Salud Pública de México

EMPLEO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR PARA LA CARACTERIZACIÓN EPIDEMIOLÓGICA DE NEISSERIA GONORRHOEAE * * Presentado Parcialmente en el "XV Congreso Internacional de Microbiología, Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas, Av. Universidad 655, col. Santa María Ahuacatitlán, 62508 Cuernavaca Morelos.

EMPLEO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR PARA LA CARACTERIZACIÓN EPIDEMIOLÓGICA DE NEISSERIA GONORRHOEAE * * Presentado Parcialmente en el "XV Congreso Internacional de Microbiología, Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas, Av. Universidad 655, col. Santa María Ahuacatitlán, 62508 Cuernavaca Morelos.

AUTORES

ELVIRA NADER-GARCIA, M.V.Z.,(1) VERÓNICA ALEJANDRA MONDRAGÓN-JAIMES, M. EN C.,(1) CARLOS JESÚS CONDE-GONZALEZ, D. EN C. (1)

(1) Departamento de Bacteriología, Centro de Investigaciones sobre Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud Pública, México.

RESUMEN

En este artículo se detalla el uso de tecnología actual para la identificación de marcadores moleculares de una colección de cepas de Neisseria gonorrhoeae. Los procedimientos de auxotipificación, serotipificación y extracción deplásmidos permitieron la descripción de 10 auxotipos, 19 serotipos y cinco tipos de plásmido (incluyendo codificadores de beta lactamasa), además de 12 perfiles de resistencia antimicrobiana, mediante la prueba de susceptibilidad por dilución seriada en agar, en un total de 41 cepas gonocócicas analizadas. Estas herramientas tienen un gran valor epidemiológico, ya que permiten conocer los aspectos dinámicos de la historia natural de la gonorrea, a la vez que han conducido en este caso al establecimiento de un centro de referencia sobre N. gonorrhoeae en nuestra institución.

Palabras Claves: gonococo, biología, molecular, epidemiología molecular

ABSTRACT

This paper describes current methods useful to define molecular markers from a collection of Neisseria gonorrhoeae strains. The procedures of auxotyping, serotyping and plasmid profiling led to the obtention of 10 auxotypes, 15 serotypes and five plasmid types (including beta-lactamase plasmids) among 41 gonococci studied. Twelve patterns oi antimicrobial resistance were determined as well, through ire vitro susceptibility testing by agar dilution. These tools in conjunction, offer the possibility to study gonorrhea in a dynamic fashion from an epidemiologic perspective. Furthermore, they have allowed us to establish a gonococcai reference laboratory in our institution.

Key words:gonococcus, molecular biology, molecular epidemiology

Solicitud de sobretiros:Dr. Carlos J. Conde G. dirección de Microbiología, Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas,Av. Universidad 655, Col. Santa María Ahuacatitlán, 62508 Cuernavaca Morelos.

Introducción

LA GONORREA ES un padecimiento que en la actualidad sigue prevaleciendo en todo el mundo,1 independientemente del grado de desarrollo socioeconómico de los diferentes países. Aunado a esto, la relativamente reciente identificación de cepas productoras de beta-lactamasa,2 la caracterización de resistencia cromosomal hacia la penicilina y otros agentes, además de la alta resistencia plasmídica a la tetraciclina, refuerzan la necesidad de llevar a cabo estudios moleculares que permitan la identificación de las características clonales de los diferentes aislamientos clínicos.

Durante los últimos 20 años se han desarrollado diferentes métodos para clasificar a las cepas de gonococo aisladas de varias partes del mundo. El método de auxotipificación,3 basado en los requerimientos nutricionales para varios aminoácidos y bases nitrogenadas, y la serotipificación,4 basada en la antigenicidad de la proteína I, que se encuentra presente en la membrana externa del gonococo, han servido de herramientas para conocer la cinética epidemiológica de la enfermedad.5 La identificación de marcadores de resistencia6 a través del método de concentración inhibitoria mínima, la detección de plásmidos productores de beta-lacta masa mediante métodos químicos directos, así como la caracterización de plásmidos en geles de agarosa permiten determinar no sólo el foco de infección en una población, sino además definir las estrategias de tratamiento y control, principalmente en las poblaciones en riesgo.

Los trabajos que describen la metodología adecuada para la caracterización epidemiológica molecular de los aislamientos clínicos de N. gonorrhoeae7,8 han permitido establecer correlaciones entre regiones geográficas, patrones de serotipo y perfil plasmídico,7 auxotipo y resistencia antimicrobiana,8,9 al igual que entre serotipo y comportamiento sexual.10

En este laboratorio se ha implementado cada una de estas técnicas, aplicándolas como primera instancia en cepas de colección, lo cual ha permitido su caracterización íntima. Por otra parte, la aplicación de metodología de frontera debe conducir al establecimiento de un laboratorio potencial de referencia, cuyo objetivo reside precisamente en la caracterización epidemiológica molecular de cepas gonocócicas, aisladas de poblaciones mexicanas de alto y bajo riesgo.

Material y Métodos

Cepas bacterianas. Se utilizaron 41 cepas obtenidas de diferentes fuentes: 20 aisladas de infección gonocócica diseminada (IGD) donadas por los Centros para el Control de las Enfermedades (CDC) de Atlanta, GA, EUA; dos (transformadas a serorresistentes) donadas por el Baylor College of Medicine, Houston, TX, EUA;11  11 cepas consideradas como control de serotipificación, donadas por SYVA Co., de Palo Alto, CA, EUA. Seis de las cepas fueron obtenidas como control de plásmidos conjugativos y productores de beta-lactamasa y dos como referencia de resistencia a la penicilina mediada por cromosoma, donadas en conjunto por las instituciones ya mencionadas.

Las bacterias se mantuvieron congeladas en caldo Luria Bertoni (LB) glicerolado al 20 por ciento12 a -70°C hasta su utilización. A su descongelación, las cepas se sembraron directamente en medio de gelosa chocolate, consistente en base de agar GC (3.6%) y hemoglobina (1%) (v/v) (Bioxon de México), suplementado con aminoácidos y cofactores al 1 por ciento (Suplemento II, Merck NC. 10728), y se incubaron a 37°C en una atmósfera del 5-10 por ciento de CO2. Antes de ser utilizadas en cada una de las fases experimentales, las cepas se sembraron en medio de Kellogg.13

Beta lactamasa. A cada una de las cepas utilizadas se le aplicó el método yodométrico14 para la identificación de la enzima beta-lactamasa. La bacteria se suspendió en una solución amortiguadora de fosfatos (SAF) (0.15 MpH 7.2). A esta suspensión se le adicionó (v/v) una solución de penicilina-fosfatos (pH 6.0) (6 mg/ml) y se incubó por 30 minutos. Se agregó un volumen de almidón al 1 por ciento, seguido de una segunda incubación por 30 minutos. Finalmente, se adicionó 1/3 del volumen de una solución de yodo (I0.16 M y IK 0.32 M). La ausencia de coloración se consideró positiva, y la coloración azul, negativa.

Concentración inhibitoria mínima (CIM). La determinación de la resistencia o susceptibilidad a quimioterapéuticos se determinó por ensayos de la CIM de los siguientes antibióticos: cloranfenicol (Cl) (Parke-Davis), dicloxacilina (Dx) (Roussel-Unclaf), espectinomicina (Sp) (Up-John), ampicilina (Am), cefazolina (Cfz) y tetraciclina (Te) (Bristol), norfloxacina (Nf) (Prosalud MsD), ceftriaxona (Cf) (Roche) y penicilina (Pe) (Lakeside). Las soluciones madre se disolvieron de acuerdo con lo sugerido por Anhalt.15 Los rangos utilizados para cada antibiótico fueron los siguientes: Cl y Dx 0.5-4 µg/ml; Cft y Cfz 0.061-1 µg/ml; Am 0.25 -4 µg/ml; Sp 2-64 µg/m1; Nf 0.06-2 µg/ml; Te 0.25-16 µg/ml y Pe 0.125-16 µg/ml. Las concentraciones de trabajo se determinaron en base a la potencia de las sales, según el CDC.16 Estas concentraciones de antibiótico se usaron en base de agar de Kellogg13 en cajas de Petri de 100 mm de diámetro. De cada una de las cepas se preparó una suspensión bacteriana en LB a una concentración de 0.5 del nefelómetro de McFarland,17 y se colocaron por separado en los pozos de un replicador tipo Steers (Replicator, Chester, FA). Posteriormente, las placas inoculadas se incubaron durante 48 horas a 37°C y en cinco por ciento de CO2. La CIM se determinó como la concentración en la cual no se obtiene crecimiento alguno, siendo los valores de corte para Am, Cft, Cfz, Cl, Dx, Nf y Pe de 1 µg/ml; para Sp de 64 pg/ml y para Te de 2 µg/ml.18,19

Determinación de auxotipo. El medio genético definido (MGD) para la determinación de auxotipo se preparó con las siguientes sales: KCI (2 mM), citrato de sodio (2 mM), NaC1 (0.2 mM), MgCl2.6H20 (1.125 mM), NH4Cl (2.8 mM), Na2SO4 (2.6 mM), K2SO4 (2.6 mM), CH3OOONa.3H2O (5.5 mM). Por separado se preparó K2HPO4 (30 mM), KH2PO4 (16 mM), biotina (2 µg/ml), ácido oxalacético (0.5 mg/ml), piruvato de sodio (3.84 mg/ml), Fe(NO3)3(6.1 mM), B-nicotinamín-adenín-dinu¬cleótido (5 µg/ml), hidrocloruro de tiamina (10 µg/ml), cocarboxilasa (10 µg/ml), pantotenato de calcio (1012g/ ml), cisteina (0.6 mg/ml) y cistina (25 µg/ml). También se prepararon aminoácidos con las siguientes concentra¬ciones finales en el MGD: Asp (24 µg/m1), Glu(28 µg/ml), Arg, Hys, Leu, y Pro (12.4 ug/1). Ile, Ser, Ala, Val, Phe, Lys, Trn, Trp y Tyr (6.2 µg/ml). Además se pesaron Hyp (10 µg/ml) y Ura (20 µg/ml). La base sólida del medio se preparó con Agar Oxoid NQ 1 (1%) y almidón (1 mg/ml), se esterilizó en autoclave, se adicionó al MGD (v/v) y se sirvió en cajas de Petri marcadas como: completo, Ura-, Hyp-, Arg-, Pro- y Met-.

Los cultivos de gonococo de 15 horas de crecimiento en Kellogg sólido se resuspendieron en MGD al 50 por ciento y se ajustó su concentración a una densidad óptica de 0.3 en una longitud de onda de 530 nm. Con el replicador de Steers se sembraron las seis cajas, se incubaron a 37°C en 5 por ciento de CO2. La lectura se hizo después de 48 horas de incubación, considerándose la ausencia de crecimiento y crecimiento fino como negativo y el crecimiento franco como positivo.

Determinación serológica. El crecimiento bacteriano de 24 horas en medio de Kellog se resuspendió en 1 ml de SAF y se calentó en baño a ebullición por 10 minutos. Ya frío, se utilizó para la coaglutinación. Los anticuerpos monoclonales se prepararon uniéndose previamente a la proteína A de células completas de S. aureus.20 Se centrifugaron 10 ml de una solución al 10 por ciento de S. aureus (peso/vol), cepa I Cowan (Calbiochem Corp., La Jolla Ca.) y se lavaron tres veces con SAF; finalmente se resuspendieron en 12 ml de SAF agitando con "vortex". Posteriormente, por separado los anticuerpos monoclonales se mezclaron con las células de S. aureus en la relación ya descrita.4 Para cada serogrupo se usaron seis anticuerpos monoclonales: 4A12, 4G5, 2F12, 6D9, 5G9 y 5D2 para IA; 3C8, 1F5, 2D6, 2G2, 2D4 y 2H1 para IB. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente por cinco minutos. Posteriormente, las células se lavaron para eliminar los anticuerpos no pegados y se resuspendieron en 10 ml de SAF. La serotipificación se realizó en laminillas de coaglutinación donde se colocaron 1 vol de anticuerpo monoclonal ligado a S. aureus y 1 vol de la suspensión de N. gonorrhoeae; se agitó suavemente (30 rpm) por dos minutos y se hizo la lectura frente a una lámpara de luz. La reacción se evaluó de acuerdo con el criterio de Knapp y colaboradores;4 se consideró como 4+ cuando presentó grumos grandes alrededor de la gota con fondo claro; 3+ cuando presentó grumos grandes distribuidos en la gota con fondo claro; 2+ cuando aparecieron grumos definidos ligeramente turbios, y 1+ o 0 cuando se observaron grumos escasos no bien definidos con fondo lechoso o cuando no aparecieron grumos con textura de leche. Esta última reacción se consideró negativa.

Obtención de plásmidos. Se utilizó una modificación del método de Birnboim- Doly.21 Las cepas se cultivaron en medio sólido de Kellog por 15-18 horas y las colonias se resuspendieron en 1 ml de LB. Las células se centrifugaron y resuspendieron en 0.1 ml de lisozima 2 mg/ml disuelta en EDTA 10 mM, Tris 25 mM (pH 8) y glucosa 5 mM; se incubaron durante 30 minutos a 4°C, y se agregaron 2 vols de una solución de NaOH 0.2 N y sDS al 1 por ciento. En seguida, la solución se incubó durante 5 minutos a 4°C; posteriormente se adicionaron 1.5 vols de acetato de sodio 3 M (pH 4.8), y se mezcló e incubó durante 30 minutos en hielo. Posteriormente la preparación se centrifugó en una microcentrífuga durante 10 minutos y se transfirieron 400 µl del sobrenadante a otro tubo. A la muestra se le adicionó 1 ml de etanol absoluto, se mezcló e incubó a -20°C por 3 horas y se centrifugó por 10 minutos. A la pastilla se le adicionaron 100 µl de acetato de sodio 0.1 M, Tris 0.05 M (pH 8) y 200 µl de etanol absoluto; se incubó 20 minutos a -20°C y se repitió la precipitación con etanol absoluto. Después se le resuspendió en 30 µl de solución TE (Tris 10 mM pH 8, EDTA I mM), se adicionó la RNASa a una concentración final de 5 tg/ml y se incubó 1 hora a 37°C. Los plásmidos se identificaron por medio de geles de agarosa al 0.7 por ciento, teñidos con bromuro de etidio en solución amortiguadora de tris-boratos y corridos a 50 V por tres horas aproximadamente.12 El DNA se observó en un transiluminador de luz ultravioleta y sus pesos fueron estimados por comparación visual con cepas testigo conocidas.

Resultados

Beta-lactamasa. De acuerdo a la interpretación del método yodométrico, se encontró que de las 41 cepas probadas, cinco (12%) produjeron la enzima.

CIM. Se observó que del 100 por ciento de las cepas utilizadas, el 51.2 por ciento fue sensible a todos los antibióticos, y el 48.8 por ciento presentó resistencia. De estas últimas, el 45 por ciento fue resistente a un quimioterapéutico y el 55 por ciento presentó multirresistencia (a dos o más agentes). La distribución de los patrones de resistencia se observa en la figura 1. El porcentaje de cepas resistentes a cada uno de los antibióticos se presenta en el cuadro I. Todas las cepas fueron sensibles a Cfz, Nf y Sp.




Auxotipificación. En la figura 2 se muestran los 10 auxotipos encontrados y su distribución en nuestra colección de cepas gonocócicas.



Serotipificación. Los 19 serotipos identificados, así como su frecuencia, se pueden observar en el cuadro II. El serotipo más encontrado fue el IA-2 (22%). De las 20 cepas de IGD aisladas de sangre o articulaciones (cuadro III), 16 (80%) pertenecieron al serogrupo IA y las cuatro (20%) restantes al IB. Solamente cuatro de estas cepas (3 del serogrupolB) mostraron ligera resistencia a un betalactámico, la dicloxacilina (cuadro IV).








Plásmidos
. El 90 por ciento de las cepas contuvieron el plásmido críptico de 2.6 Megadaltones (Md); el 22 por ciento el plásmido conjugativo (24.5 Md). Se encontraron cinco plásmidos productores de beta-lactamasa (12%). En las cepas 76p, 76-061786 y 77, se identificó el plásmido Africano (3.2 Md), en la 87p el plásmido Toronto (3.5 Md) y en la 76-073389 el plásmido Asiático (4.4Md).

Con respecto al contenido de plásmidos en las cepas mGD, dos de ellas no tuvieron el plásmido críptico pero sí el conjugativo. De las 18 restantes, tres presentaron la combinación de plásmidos críptico-conjugativo (cuadro III).

Del subgrupo de cepas totalmente sensibles a los antimicrobianos y no provenientes de infecciones invasivas, D4 y G7 pertenecieron a las variedades Pro—/IA6 y Met—Pro Ura—/IA5 respectivamente; ambas presentaron el plásmido críptico únicamente. Las otras cepas del subgrupo, F62, WM3 y WM6, están relacionadas porque las dos últimas son F62 transformadas a serorresistencia con material genético de un aislamiento de IGD;11aún así fue interesante observar que las tres compartieron el mismo perfil: Pro/1B7 y p 2.6 Md.

Discusión

Como se describió en la metodología, seis de las cepas donadas fueron enviadas como cepas control de resistencia ala penicilina mediada por plásmido. Sin embargo, en el laboratorio sólo cinco de ellas fueron positivas al ensayo yodométrico, a la ciM esperada por encima del valor de corte, así como a la presencia de plásmidos productores de beta-la cta masa evidenciados por electroforesis. Esto sugiere la pérdida del plásmido en una de ellas (26p), probablemente al sujetarla a liofilización en su sitio de origen, o por la ausencia de presión selectiva al resembrarla. No obstante, esta cepa fue resistente cromosomalmente a Dx, Pe y Te (cuadro IV). Asimismo, los resultados del antibiograma obtenidos en estas cepas (76p, 87p, 76-061786, 76-073389 y 77) indican que la resistencia es mediada por plásmidos, ya que el valor de la CIM para Pe fue > 16 µg/ml19 (cuadro IV).

Por otra parte, se observa una correspondencia entre la resistencia a la Pe mediada por plásmido y la resistencia a la Am, Cft y Cl, no así en todos los casos con la Dx. Es probable que la presencia del plásmido influya en la resistencia a algunos antimicrobianos beta-lactámicos. Debe destacarse que la resistencia a Cft y cefalosporinas de tercera generación es mínima en cepas de campo,19 y nuestras cepas que mostraron tal carácter forman parte de los controles del CDC.

Igualmente, también se observan algunas cepas con resistencia mediada cromosomalmente, además de las
cepas F18 y F45, las cuales fueron obtenidas por sus marcadores cromosomales (cuadro IV). De éstas, las cepas F6, N10 y 7122 presentaron resistencia cromosomal a la penicilina, así como a otros antimicrobianos debido a la resistencia cruzada ampliamente reportada.22

Ninguna de las cepas IGD fue resistente a la penicilina; el ensayo yodométrico también fue negativo, y en geles de agarosa no se observaron plásmidos beta-lactamasa. Estos resultados coinciden con los informados por otros autores, 23 los cuales observan únicamente la presencia de plásmidos críptico y conjugativo para este tipo de cepas.

El auxotipoAHU frecuentemente relacionado con cepas IGD,4,23,24 no coincide con nuestros resultados (cuadro III); esto quizá se deba a que el número de cepas probadas espequeño. Además, la totalidad de estas cepas no han sido probadas en su capacidad de serorresistencia (experimentos en desarrollo). Por otra parte, el 80 por ciento de las cepas IGD presentaron el serogrupo IA, coincidiendo con lo anteriormente notificado (cuadro III).23,25,26

Como ya se mencionó, la importancia de la caracterización de los plásmidos al igual que el auxotipo/serovar trabajados en este informe, reside en la determinación del comportamiento epidemiológico de la enfermedad, así como en la identificación de focos de diseminación y tratamiento.

En el caso de los plásmidos conjugativos (24.5 y 25.2 Md), su importancia reside en la capacidad que ellos confieren de transferir otros plásmidos beta-lactámicos a cepas de flora normal u otras cepas gonocócicas, lo que permite la persistencia de microorganismos resistentes.26

Es importante recalcar que este trabajo no es reflejo de un comportamiento epidemiológico, ya que el 50 por ciento de las cepas trabajadas fueron obtenidas por sus características genotípicas y no son muestras aleatorias de una población. El 50 por ciento restante de las cepas trabajadas fueron obtenidas de IGD, lo que podría considerarse como un comportamiento representativo. Sin embargo, fueron aisladas de pacientes de diversos sitios geográficos y en épocas diferentes por lo que poco se puede decir de su conducta epidemiológica. En conclusión, disponemos ahora de una colección de cepas totalmente caracterizadas que serán útiles para propósitos de referencia y adiestramiento en las funciones de servicio de esta institución.

Por ahora se cuenta con sólo un reporte epidemiológico del tema desarrollado aquí, a nivel nacional, donde los hallazgos mostraron frecuencias de gonorrea entre el 10 (prostitutas) y el 38 por ciento (varones heterosexuales y homosexuales), con un total de ocho serovariedades y tres auxotipos reconocidos y resistencia a varios antimicrobianos, en especial a la penicilina, mediada por plásmidos asiáticos y africanos, sin encontrar alta resistencia a la tetraciclina. Un dato importante fue asociar únicamente tres clases de auxotipo/serovar a los aislamientos resistentes a betalactámicos.27

La utilidad y el enriquecimiento de la información existente, al aplicarla epidemiología molecular al estudio de la gonorrea, se logrará en la medida que existan investigaciones colaborativas entre múltiples laboratorios interesados en documentar particularmente el impacto de la gonorrea en grupos de alto riesgo para adquirir enfermedades transmitidas sexualmente.


AGRADECIMIENTOS


Al doctor Richard Rodgers de Laboratorios SYVA, Palo Alto, CA, USA; por el suministro de los anticuerpos monoclonales. Esta investigación fue sufragada parcial
mente con el Fondo de Repatriación para Científicos Mexicanos, otorgado a CJCG por la Fundación Mexicana para la Salud y la Carnegie Corporation of New York. A la señorita Obdulia Escobar se le agradece el eficiente mecanografiado del artículo.

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