Salud Pública de México

A 11 AÑOS DEL DESCUBRIMIENTO DEL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA

A 11 AÑOS DEL DESCUBRIMIENTO DEL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA

AUTORES


CARMEN SOLER CLAUDIN, Q.F.B., M. EN C.(1) JOSE CARMEN GUDIÑO ROSALES BIOL.(1)

(1) Unidad de investigación en Retrovirus Humanos, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, e Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, Secretaría de Salud, México.

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue caracterizar la región V3 en los VIH-1 aislados de pacientes mexicanos. Se estudió la  secuencia del producto obtenido por amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa de la región variable 3  de siete aislados de VIH-1 provenientes de pacientes residentes en la República Mexicana infectados por vía  sexual o sanguínea. Con estos fragmentos amplificados se obtuvo la secuencia de nucleótidos de la región comprendida  entre las dos cisteínas de la gp120 viral y se dedujo la secuencias de aminioácidos de la misma (347-382 de la  secuencia de consenso). En promedio la homología entre las secuencias de los aisladores mexicanos fue del 61.4%. Se  demostraron tres grupos de subtipos virales: uno correspondiente a pacientes que adquirieron la infección  por vía sexual, otros de virus de origen sanguíneo y en tercer grupo de una gran similitud al virus prototipo HTLV- III/LAV El análisis de sitios antigénicos en esta región muestra por lo menos tres patrones de neutralización para  estos aislados y un caso en el cual no se encuentra ningún epitopo de alto valor predictivo en esta región. Los datos muestran que en nuestro países presenta una gran heterogeneidad en los virus circulantes, la cual es equivalente a la reportada en otras regiones del mundo.

ABSTRACT

The nucleotide sequence of the human immunodeficiency virus (HIV-1) gp120 variable region (V3) was obtained by sequencing  the product of the Polymerase Chain Reaction (PCR) amplification of seven HIV-1 Mexican isolates from patients  who had been infected either showed a 61.4% homology between them and three viral subtypes were demonstrated. One of these  corresponds to three sexually infected patients, another to two hemophiliac patients infected through blood products or  transfusions and the third subtype to either sexually or blood infected patients. The latter shows a great similar ity  to the HTLVIIIb/LAV prototype strain. Antigenic profiles of this region show at least three neutralization patterns for  these isolates as well as one virus that does not have a high predictive value epitope in the V3 region. Our data show that  Mexico has a high heterogeneity of HIV-1 circulating strains, similar to that reported in other regions of the world.

Introducción

DESDE EL PUNTO de vista biomédico ha sido fundamental identificar al agente etiológico del SIDA, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH): sin embargo, dada su gran complejidad esto no ha bastado para definir una estrategia de control.

 
El conocimiento de las interrelaciones entre las características biológicas del agente viral, los factores del hospedero que lo hacen más o menos susceptible a la infección y los mecanismos patogénicos del virus sobre las células blanco, proporcionará la base médica para enfrentar esta epidemia.

El VIH, considerado actualmente como el agente causal del SIDA, pertenece a la familia de los retrovirus, conocidos desde hace mucho tiempo como patógenos animales. Sin embargo, Su relación con los humanos no se demostró sino hasta los
años ochenta, cuando se descubrió el primer retrovirus humano: el de la leucemia/linfoma de células T humanas tipo I, conocido como HTLV-I. Los retrovirus se pueden clasificar de acuerdo con el tipo de transmisión, con su rango de hospederos, o con su morfología: empero, la clasificación más empleada es aquélla basada en sus propiedades biológicas y patogénicas. Según este último criterio, existen tres subfamilias. oncoviridae, espumaviridae y lentiviridae.
Los oncovirus, entre los cuales se encuentran el HTLV-I y el HTLV-II, asociados a tumores malignos; los lentivirus como el VIH-1 o el VIH-2, asociados a desórdenes inflamatorios y degenerativos progresivos. Los espumavirus hasta ahora no han sido asociados a ninguna enfermedad en humanos.
La subfamilia de los lentivirus está compuesta por virus no transformantes, citopáticos, a la cual pertenecen algunos virus prototipo conocidos desde hace muchos años y que afectan a diversas especies animales, como el VISNA o bien el
virus de la artritis-encefalítica caprina. (1)
En 1981 se describe una nueva enfermedad humana, el SIDA, y en 1983 se reporta el aislamiento de un retrovirus en pacientes que presentaban síndrome de linfadenopatía. A este nuevo retrovirus el grupo del doctor Luc Montagnier del Instituto Pasteur lo denominó LAV. Durante el siguiente año el grupo de R. Gallo, en Estados Unidos, aisla retrovirus similares en diversos pacientes y descubre una línea celular que permite su crecimiento in vitro, llamándolos HTLV-III; el grupo de J. Levy, en California, los denomina ARV.Actualmente se conocen con el nombre de virus de inmunodeficiencia humana o VIH.2-4
Las partículas del VIH son de forma esférica y están formadas por una membrana lipídica de origen celular, que contiene dos proteínas virales asociadas: una glicoproteína externa (gp120) y una transmembranal (gp41). Por debajo de esta
envoltura se encuentra una segunda capa proteica formada por la polimerización de monómeros de la proteína viral p17, dentro de la cual se encuentra la nucleocápside, constituida por la proteína p24 y dos moléculas de ARN viral, que son el material genético del virus. El ARN tiene asociadas moléculas de la enzima transcriptasa reversa (TR). (5,6)

El material genético del VIH está constituido por dos moléculas de ARN, de cadena sencilla y polaridad positiva; esto es, que teóricamente podría funcionar como ARN mensajero (ARNm) para la síntesis de proteínas. Sin embargo, durante el ciclo de replicación, la transcriptasa reversa se encarga de sintetizar una molécula de ADN de doble cadena empleando el ARN viral como molde. Al insertarse en el genoma de la célula, este ADN recién sintetizado constituye lo que se denomina provirus.

El genoma del VIH comparte con todos los retrovirus la disposición básica de los genes para las proteínas estructurales gag, pol y env. El provirus tiene en sus extremos unas secuencias llamadas repetidos terminales largos (RTI), que contienen elementos reguladores de la expresión viral como el promotor y secuencias aumentadoras de la transcripción (figura 1). 5,7-13


El ciclo infeccioso comienza con la exposición de un individuo al agente etiológico. Una célula puede infectarse por dos mecanismos: con una partícula viral libre o por el contacto con una célula ya infectada. La alta afinidad de la proteína gp120 por la proteína CD4 de la superficie celular, determina el tropismo preferencial del VIH hacia células con este marcador.De los diferentes grupos celulares CD4+. los linfocitos T cooperadores presentan una gran cantidad de este marcador. de tal manera que son las células que tienen mayor probabilidad de ser infectadas. 14-17 Inicialmente se pensó que sólo los linfocitos T cooperadores (T4) eran las células blanco del virus: hoy se sabe que el VIH puede infectar otras células humanas, incluyendo macrófacos y diversas células del sistema hematopoyético, de las mucosas del intestino y del endometrio, del cerebro, de la piel, etcétera. El efecto del virus es diferente en los distintos tipos de células. 18

Se ha probado que existen diversos mecanismos de entrada del virus a las distintas células: el primero que se notificó es el relativo a la interacción de la glicoproteína viral externa gp120 con el receptor celular CD4. Esta unión es altamente específica y se da prioritariamente en los procesos de infección de células blanco que contengan este receptor en su membrana. Otro mecanismo de infección notificado es el que se produce en el cerebro y el intestino, donde las moléculas de galactosil-ceramida funcionan como receptores alternos.

Adicionalmente se sabe que una vía importante de ingreso de
virus a determinadas células se produce a través de la formación de complejos con anticuerpos, que contribuyen a facilitar la entrada del virus a través de la interacción de una porción de esos anticuerpos (Fc) unidos al virus, con un receptor celular específico. Existe evidencia que sugiere la presencia de otro receptor para la entrada del virus, al cual se le ha llamado receptor de fusión, y se piensa que dicho factor interactúa con la glicoproteína transmembranal (gp41) del virus. 14,18-21

Por cualesquiera de las vías el virus entra en contacto con alguna célula susceptible y después, probablemente mediante la fusión de las membranas viral y celular, la nucleocápside penetra al citoplasma, 21-23 en donde se desintegra y son liberados el ARN viral y las enzimas TR e integrasa.

Utilizando factores celulares. La TR se en carga de copiar la
secuencia de nucleótidos del ARN viral, para sintetizar un genoma de ADN de doble Cadena. El proceso de la transcripción reversa involucra, al menos, tres actividades que realiza una misma entidad proteica: la síntesis de ADN dependiente de un molde de ARN; la degradación de la hebra de ARN original y la síntesis de la cadena de ADN complementaria. Posteriormente la integrasa realiza cortes en el ADN viral y celular para permitir que el genoma del provirus sea integrado al de la célula quedando ésta permanentemente infectada (figura 2). 24-26






Una célula infectada puede permanecer en un estado latente por tiempo indefinido, durante el cual el virus se expresa en niveles muy bajos. 27 o bien pasar a un estado de expresión activa del virus. En la transición de un estado de latencia a otro de expresión activa del virus actúan diversos factores, como los virales en la aparición de variantes más patógenas: las condiciones del hospedero, por ejemplo su estado inmunocompetente, o los estímulos externos, como la infección con otros patógenos.28

El ADN proviral se transcribe a un ARN precursor, para lo cual se emplean las enzimas celulares, en este caso la ARN polimerasa II. El ARN precursor se procesa por: a) la poliadenilación en el extremo 3', conservando el largo genómico (9 Kb): y, b) el procesamiento (splicng) de una fracción de los transcritos completos, generando dos tipos de ARNm subgenómicos (4.5 y 2 Kb), de los cuales se han identificado diversas especies. Los tres tipos de ARNm formados (9,4.5 y 2 Kb), que comparten los extremos 5' y 3' entre sí y con el ARN genómico, son transportados al citoplasma, en donde:

- Los transcritos de largo completo (9 Kb) se usarán ya sea
como ARN genómico, o para ser traducidos en polirribosomas libres, a gag y la proteína precursora de pol. Se desconoce el mecanismo de selección para una u otra vía.

- Los transcritos de 4.5 Kb se traducen en polirribosomas unidos a membrana de retículo endoplásmico sintetizándose el precursor de las glicoproteínas virales (gp160), el cual es glicosilado y procesado en retículo endoplásmico y aparato de Golgi.

- Los transcritos multi-procesados de 2 Kb son traducidos en las proteínas producto de los genes reguladores (tat, rev ef; vif, vpu y vpr). El balance de los productos de procesamiento es el que controla la cantidad de las proteínas virales que se sintetizan. Este paso de procesamiento no parece estar afectado por productos virales: sin embargo, aparentemente sí existe una relación con la promoción de s transporte hacia el citoplasma. 29,30

Diversos genes codifican para proteínas reguladora en los VIH, de los cuales tat y rev han sido ampliamente estudiados,ya que son reguladores positivos de la expresión viral, es decir, activan la replicación y su acción es esencial. Otros
tres productos proteicos, vif, vpr y vpu, son importantes para la infectividad, pero no esenciales para la replicación: finalmente, nef es un regulador negativo, es decir, inhibe la expresión genómica. 31-35

Los mecanismos de la expresión del genoma del VIH no están completamente dilucidados: incluyen la acción de diversas proteínas virales -tat, rev y nef- que ejercen su acción en puntos distantes del genoma de aquél en que son codificadas,
además de factores celulares específicos y de otras proteínas, codificadas por otros virus, que también ejercen su acción a distancia.

La regulación de la expresión viral por factores celulares ha sido uno de los mayores retos para los investigadores que trabajan con retrovirus. Hay mucha maneras teóricas en que un retrovirus puede interaccionar con su célula hospedera: por ejemplo, el virus puede inducir la síntesis de algunas proteínas celulares que funcionen como moduladoras de la expresión de los genes virales, como es el caso de la gp120, que altera la concentración de calcio intracelular y estimula las señales específicas de transducción. Una estrategia diferente seria la de que el virus, después de integrar su genoma, espere a que la célula exprese las proteínas que regulan la síntesis viral, como la NF-kB que es un factor de transcripción inducible y que estimula la transcripción viral después de la activación celular. También el virus puede inducir la síntesis de proteínas celulares que no afectan su expresión, pero que ejercen un efecto patogénico en la propia célula hospedera o en células blanco: esta hipótesis se ha relacionado con el sarcoma de Kaposi, en el que se encuentran estimulados diversos factores de crecimiento. Finalmente, la célula hospedera puede servir de transmisor de señales de un tipo de virus a otro, activando así la replicación viral, por ejemplo herpesvirus, citomegalovirus y adenovirus que activan la replicación y/o la expresión génica del VIH. 36-38

La variabilidad entre aislados tiene impacto sobre algunas propiedades muy importantes de los VIH, como la especificidad de tejidos y de células blanco del aislado en particular, o sea su tropismo. La patogenicidad y, por lo tanto, el espectro de síndromes clínicos que ocasionan dichos aislados, también se ve afectada al modificarse la virulencia de éstos, mas no hay claridad todavía respecto a la relación entre la variación biológica de los aislados de VIH y la variación en sintomatología observada en los individuos infectados. 39-43

Asimismo se ha observado que la distribución temporal y geográfica de los VIH es variable. Se sabe que los aislados obtenidos en Africa son más divergentes entre sí que los encontrados en los Estados Unidos o en Europa. Tal vez uno de los impactos más importantes de esta variabilidad se ubique en la antigenicidad de las cepas de VIH, puesto que se produce un drift genético. Estas variaciones se reflejan en los dominios de neutralización y de inducción de respuesta T citotóxica, complicando el posible desarrollo de vacunas efectivas. 44-46

En 1987 se identificó al dominio principal de neutralización (DPN) del VIH-1, el cual se localiza hacia el extremo carboxilo-terminal de gp120, en la región variable 3 (V3). Esta región, aunque presenta una alta variabilidad en su secuencia de nucleótidos y aminoácidos, tiene una estructura terciaria conservada, en forma de asa, mantenida por puentes disulfuro y su tamaño es entre 34 y 36 aminoácidos de largo. En el centro de ésta se localiza el tetrapéptido GPGR altamente conservado entre diferentes aislados, el cual es la parte central del DPN.47-49

Numerosos trabajos señalan que esta región tiene una participación importante durante el ciclo infeccioso, de tal manera que los anticuerpos dirigidos en su contra presentan actividad neutralizante. De estos estudios se desprende que la V3 puede ser un epitopo de importancia para el desarrollo de vacunas que induzcan una buena respuesta de anticuerpos neutralizantes.

Mediante el empleo de péptidos sintéticos se determinó que la parte central del DPN (GPGR y aminoácidos adyacentes) induce anticuerpos grupo específico, capaces de neutralizar varias cepas virales. Por otro lado, las regiones intermedias entre el GPGR y cada cisteína inducen anticuerpos tipo específico, que neutralizan solamente al virus inductor o a cepas muy relacionadas con éste.(50,51) Además, se ha encontrado que la V3 también puede inducir respuesta de lintocitos T citotóxicos.46,52

En vista de la importancia que tiene la región V3 como sitio estratégico para el desarrollo de vacunas contra el VIH-1 debido a su capacidad de inducir anticuerpos neutralizantes, a la alta variabilidad de esta región, y al hecho de que la secuencia de aminoácidos del DPN proporciona información sobre el fenotipo de los diferentes virus-, se considera importante caracterizar la región V3 en los VIH-1 aislados de pacientes mexicanos. En este trabajo se informa acerca de los primeros resultados de caracterización molecular de cepas de VIH aisladas de pacientes en México. Se estudió la secuencia nucleotídica de la V3 de la glicoproteína externa gp120.

Material y Métodos

Se colectó sangre con anticoagulante de diversos pacientes y se sometió a un gradiente de ficoll-hipaque, obteniéndose las células mononucleares periféricas (CMP) con las cuales se estableció un cocultivo (1:1) con CMP de individuos VIH-1 y hepatitis B negativos, las cuales habían sido pre-activadas por 48-72 horas con fitohemaglutinina (PHA; 5æ/ml. Sigma Co.) y tratadas por 30 min con Polibrene (concentración final 2æg/ml. Sigma Co.) Los cocultivos se mantuvieron en medio RPMI-1640, suplementado con 20% de suero fetal bovino. 1% de mezcla de antibióticos-antimicóticos (GIBCO) y 50 U/ml de Interleucina-2 recombinante (Sigma Co.). A los virus obtenidos en estos cocultivos se les denominó cultivos o aislados primarios.

Para establecer cultivos virales en líneas celulares permanentes, se procedió de la siguiente manera: una vez que un cultivo primario se consideró positivo mediante la detección de antígeno (HIVAG-1; Abbott Laboratories) en el sobrenadante del cultivo, se realizó un nuevo cocultivo, esta vez mezclando células del cultivo primario positivo con células de una línea inmortalizada (Molt o SupT1). Los cultivos en línea celular se mantuvieron en medio RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal y ICc de mezcla de antibióticos-antimicóticos, hasta lograr un porcentaje de células infectadas superior al 90% determinado por inmunofluorescencia de células fijadas. A estos cultivos se les denominó aislados en líneas celulares.

Se cosecharon por centrifugación a 1 500 rpm entre dos y 10 millones de células de los diversos cultivos, procediéndose a la extracción de ADN, la cual se realizó mediante lisis celular con SDS (dodecyl-sulfato de sodio) y tratamiento con Proteinasa K, para posteriormente realizar la extracción con fenol/cloroformo y precipitación del ADN con acetato de sodio/etanol.53

La región del genoma correspondiente a la V3 se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizándose los iniciadores KSI 5' y KSI 3'54 que permitieron amplificar un fragmento de 320 pb (nucleótidos 6589 a 6859).55 Los ensayos se realizaron empleando 1 æg de ADN extraído del cultivo correspondiente, 50 mM KCI. 10 mM Tris-HCI pH 8.3. 1.5 mM MgCI-2+ 0.51 æM de cada iniciador, 0.2 mM de dNTPs y 2U Taqpolimerasa en un volumen final de 100 æh Se realizaron 35 ciclos de amplificación a 95 C 1 min, 5 C 1 min y 72 C 2 min. El producto de amplificación se purificó por el método de agarosa de bajo punto de fusión y se cuantificó por electroforesis en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio.56

La secuencia de la región V3 de los diferentes aislados de VIH-1 se obtuvo por el método de Sanger, utilizando 35 S dATP como marcador. Entre 150 y 200 ng de ADN de doble cadena obtenido por la PCR se sometieron a la reacción de secuenciación con el estuche Sequenase versión 2.0. (USB), empleando protocolos estándar para secuenciar regiones cercanas al iniciador, como lo indica el fabricante. Para secuenciar el producto de PCR se utilizó como iniciador el oligonucleótido KSI 5'. Las secuencias se resolvieron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (6%) con urea (7.5 M) y se trataron con una solución fijadora (metanol 10%/Ac. acético 10%, 15 min), se secaron a 80 C por una hora y se expusieron a placas de rayos X por lo menos durante 48 horas. Las secuencias se leyeron visualmente y se procesaron con el software PC-genes. Muestras: los ADN empleados para la amplificación se obtuvieron de aislados de VIH-1 de distintos individuos:algunos correspondientes a aislados primarios mantenidos en cocultivos con CMP, y otros establecidos en líneas celulares permanentes de origen linfocitario humano. Se trabajaron los aislados codificados como: MXC 14-1. MXC20-1, MXC23, MXP42m, MXP42p, MXP4 y MXP5. Como control de los distintos pasos y como referencia, se secuenció simultáneamente la región equivalente del virus prototipo HTLV-IIIb/LAV encontrada en el plásmido pBH10 que contiene casi íntegro el genoma de dicho virus.

Resultados

Al comparar las secuencias nucleotídicas de la región V3 obtenidas de los distintos aislados, se encontró que los porcentajes de similitud más altos (> 85%) se presentaron en las secuencias de MXC 14-1 y MXC23 con la del pBH10. Entre las secuencias de los aislados realizados en México estos porcentajes van desde el 47% (MXP42p/MXP5) al 84.8% (MXC14-1/MXC23). En promedio la homología entre las secuencias de los aislados mexicanos fue del 61.4%.

Utilizando el menú clustal del PC-genes, se llevó a cabo un análisis filogenético entre las secuencias de los virus mexicanos, el cual permite la formación de grupos, dependiendo de las similitudes entre ellos. Al comparar las secuencias obtenidas experimentalmente, se encontraron tres grupos: uno formado por la secuencia del pBH10 y las de los aislados MXC14-1 y MXC23; otro formado por las secuencias de MXC20-1, MXP42m y MXP42p.; y un tercero constituido por dos virus aislados de pacientes hemofílicos: MXP4 y MXP5 (figura 3).




Los estudios de la filogenia de los distintos aislados virales reportados en la literatura tanto para secuencias del gene gag como para env, han revelado la existencia, hasta el momento, de seis genotipos a nivel mundial, según la base de
datos de retrovirus humanos de Los Alamos,(57) los cuales son: Subtipo A, virus aislados en Africa Central y en el Oeste de Africa; Subtipo B, virus aislados de América, Europa y Asia; Subtipo C, virus del sur de Africa, Africa Central y la India; Subtipo D, virus de Tailandia y Africa Central; Subtipo E, virus aislados de Africa Central; y, Subtipo F, virus aislados en Rumanía y Brasil.

Cada subtipo está formado por virus cuyas secuencias presentan porcentajes de divergencia, a nivel nucleotídico, de entre el 7 y el 20%, mientras que las divergencias entre dos subtipos son del 20 al 35%. Las secuencias que no pueden
ser clasificadas en estos subtipos se han integrado en un subgrupo llamado "Subtipo U", de virus "no clasificables".

A pesar de que el tamaño de las secuencias obtenidas en el presente estudio no es el óptimo para realizar estudios filogenéticos con alto índice de confiabilidad, se intentó determinar a qué subtipos de virus pertenecen las secuencias
V3 de estos aislados mexicanos. Los resultados del análisis se presentan en la figura 4.





Se detectó que el aislado MXC20-1 está relacionado con en genotipo B, al cual pertenecen casi todos los VIH encontrados en América. De los aislados, MXP42m y MXP42p provenientes de una pareja se distribuyeron entre los subtipos consenso; el aislado MXP42m se colocó en una posición intermedia entre los genotipos D (Africa Central y Tailandia) y E (Africa Central), mientras que MXP42p quedó cercano al genotipo D.

Las secuencias de otros dos aislados, MXC14-1, MXC23, que formaron un grupo con la del pBH10, así como las secuencias de MXP4 y MXP5 en otro grupo, se incluyen dentro de los denominados virus no clasificables, según la base de datos de los Alamos (subtipo U), ya que no pudieron agruparse con ninguno de los genotipos consenso.

Utilizando el menú antigen del PC-genes, se realizó el análisis teórico de la presencia de determinantes antigénicos en la región V3 obtenida para los aislados mexicanos. Según Hops y Woods, este análisis se basa en asignar un valor de hidrofilicidad a cada aminoácido; se obtiene el valor promedio de hexapéptidos a todo lo largo de la secuencia; se determinan los sitios de mayor valor promedio y se comparan con los de los sitios antigénicos determinados teórica y experimentalmente para un grupo de 12 proteínas. Se ha determinado que los índices de valor más grande en una secuencia problema se correlacionan al 100% con determinantes antigénicos conocidos.

El análisis con este programa permite obtener los principales epitopos de una secuencia particular, con su índice de hidrofilicidad. Se asume que los epitopos cuyo índice es mayor a 1 son 100% probables de ser determinantes reales, mientras que en epitopos con valor inferior a 1 disminuye la probabilidad de ser antigénicos.

En el cuadro I se muestran los resultados de la búsqueda de los sitios antigénicos en las secuencias del presente estudio; en las áreas sombreadas se indican las regiones cuyo índice de hidrofilicidad resultó mayor que 1, habiéndose tomado como epitopos reales, según las consideraciones anteriores sobre el método de Hops y Woods.

De acuerdo con lo notificado en la literatura, la región V3 es un sitio inmunodominante, como lo sugiere el hecho de que la mayoría de estas secuencias presentan epitopos antigénicos. Se observa que la zona entre la primera cisteína y la secuencia GPGRAF es muy inmunogénica, ya que del total de ocho secuencias, siete tienen epitopos predecibles en esta región.

Dado que la región V3 es un sitio determinante en la inducción de anticuerpos neutralizantes y con base en las secuencias obtenidas, se podrían esperar al menos tres patrones de neutralización para estos aislados: uno sería el grupo de sueros que neutralizaran los virus únicamente con la secuencia NNNTRK(S/G)I; otro, los virus que, además, tienen el epitopo QRGPGR y el tercer grupo neutralizaría al virus
MXP4 con el epitopo ERPNND.

Discusión

Los resultados muestran que en México, al igual que lo notificado en otras regiones del mundo, existe una gran  diversidad de cepas de VIH en circulación.

Considerando la secuencia de la región correspondiente a V3, se obtuvieron tres grupos de subtipos virales: el primero  corresponde a dos aislados (MXC14-1 y MXC23) que presentan la característica, común con el virus prototipo HTLV-IIIb/LAV, de tener en las posiciones 15-16 los aminoácidos QR, respectivamente. Estos dos aminoácidos sólo se han reportado internacionalmente en este virus prototipo, lo cual lleva a pensar que ambos aislados pudieran ser un artificio debido a contaminación de los cultivos con el virus prototipo, que regularmente es crecido en grandes concentraciones en el laboratorio, o con el propio producto de amplificación de PCR de la región V3. Asimismo corrobora esta posibilidad el hecho de la alta homología encontrada en las secuencias de estos dos virus entre sí y con el virus prototipo (MXC14-1/pBH10, 91.6%; MXC23/pBH10, 85.7%. MXC14-1/MXC23, 84.8%).

Sin embargo, datos procedentes de otro trabajo llevado a cabo en este laboratorio, indican que dichos virus corresponden a distintos grupos de neutralización cuando ésta se realiza con sueros policlonales provenientes de pacientes infectados.

Los otros dos grupos encontrados (MXC20-1, MXP42m y MXP42p y P4 y P5) corresponden, respectivamente, a virus aislados de pacientes que adquirieron la infección por vía sexual y por productos sanguíneos (pacientes hemofílicos). Los tres primeros virus, aunque similares entre sí (MXC20/MXP42m/p con 68.6% de homología, mientras que MXP42m/MXP42p presentan 82.9%), se ubican en subtipos diferentes al ser comparados con los subtipos genéticos de la base de datos de Los Alamos.

El MXC20-1, fue aislado en 1989 y es muy parecido a los virus encontrados en los Estados Unidos de América y en Europa, mientras que MXP42m y MXP42p corresponden a virus aislados en 1993 y provenientes de un matrimonio que se infectó por vía sexual y, curiosamente, son similares a virus aislados en Tailandia y Africa Central.

El otro grupo de virus, que proceden de dos pacientes homofílicos infectados por el uso de factor VIII y/o transfusiones contaminadas, se ubica dentro de los llamados virus no clasificables. La homología entre sus secuencias es de 58.8%.

Los datos genéticos del subgrupo de neutralización corresponden también a los mismos grupos de virus. Resulta interesante que el virus MXP5 no presente ningún epitopo de alto valor predictivo en la zona correspondiente a V3. Estos subgrupos de neutralización se están caracterizando por ensayos in vitro en otro proyecto que se realiza en este laboratorio, y que permitirá confirmar si los datos moleculares pueden o no ser extrapolados a la inducción in vivo de anticuerpos neutralizantes.

Es necesario ampliar este tipo de estudios, tanto en número de aislados como en regiones del genoma viral que se secuencien, a fin de emitir datos confiables sobre los tipos virales que circulan en México.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo técnico brindado en toda el área de aislamiento viral por la Q.F.B. María del Carmen Basualdo Sigales.

Bibliografía

1. Teich N. Taxonomy of retroviruses. En: Weiss R, Teich N. Varmus H, Coffin J, ed. RNA tumor viruses. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1984:12:25-207.
2. Barre-Sinoussi F, Cherman JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamaret S. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for AIDS. Science 1983; 220:868-871.
3. Gallo RC. Sallahuddin SZ, Popovic M. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 1984; 224:500-503.
4. Levy JA, Hoffman AD, Kramer SM, Landis JA. Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS. Science 1984; 225:840-842.
5. Shaw GM, Hahn BH, Arya SK. Molecular characterization of Human T-cell leukemia (lymphotropic) virus type III in the acquired immune deficiency syndrome. Science 1984; 226:1165-1171.
6. Wong-Staal F. Gallo RC. Human T-lymphotropic retroviruses. Nature 1985; 317:395-403.
7. Jones KA. Kadonaga JT, Luciw PA, Tjian R. Activation of the AIDS retrovirus promoter by the cellular transcription factor Sp1. Science 1986; 232:755-759.
8. García JA, Wu FK, Mitsuyasu R, Gaynor RB. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO J 1987; 6:3761-3770.
9. Wu F, García J, Mitsuyasu R, Gaynor R. Alterations in binding characteristics of the human immunodeficiency virus enhancer factor. J Virol 1988; 62:155-158.
10. Fisher AG, Feinberg MB, Josephs SF. The transactivator gene of HTLV-III is essential for virus replication. Nature 1986; 320:367-371.
11. Franza BR, Josephs SF, Gilman MZ. Characterization of cellular proteins recognizing the HIV enhancer using a microscale DNA-affinity precipitation assay. Nature 1987; 330:391-395.
12. Jones KA. HIV trans-activation and transcription control mechanism. New Biol 1989; 1:127-135.
13. Bielinska A, Krasnow S, Nabel GJ. NF-kB-mediated activation of the human immunodeficiency virus enhancer: Sites of transcriptional initiation is independent of the TATA box. J Virol 1989; 63:4097-4100.
14. Dalgleish AG, Beverly PC, Claphman PR. The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus. Nature 1984; 312:763-767.
15. Klatzmann D, Chanpagne E, Chambert S. T-lymphocyte T4 molecule behaves as receptor for the human retrovirus LAV. Nature 1984; 312:767-771.
16. Maddon PJ, Dalgleish AG, McDougal JS. The T4 gene encodes the AIDS virus receptor and is expressed in the immune system and in the brain. Cell 1986; 47:333-348.
17. Sattentau QJ, Weiss RA. The CD4 antigen: Physiological ligand and HIV-1 receptor. Cell 1988; 52:631-633.
18. Levy JA. HIV: A decade of research. X International Conference on AIDS. Plenary Session Handout. 1994 agosto 7-11; Yokohama, Japón.
19. Takeda A, Tuazon CU, Ennis FA. Antibody enhanced infection by HIV-1 via Fc receptor mediated entry. Science 1988; 242:580-583.
20. Freed EO, Delwart EL, Buchschacher GL. Panganiban AT. A mutation in the human immunodeficiency virus type 1 transmembrane glycoprotein gp41 dominantly interferes with fusion and infectivity. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:70-74.
21. Berger EA, Sisler JR, Earl PL. Human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein molecules containing membrane fusion-impairing mutations in the V3 region efficiently undergo soluble CD4-stimulated gp 120 release. J Virol 1992; 66:6208-6212.
22. Gabuzda DH, Lever A, Terwilliger E. Effects of deletions in the cytoplasmic domain on biological functions of human immunodeficiency virus type 1 envelope glicoproteins. J Virol 1992; 66:3306-3315.
23. Shioda T, Levy JA, Cheng-Mayer C. Macrophage and T-cell tropism of HIV-1 are determined by specific regions of the envelope gp120 gene. Nature 1991; 349:167-169.
24. Bushman FD, Fujiwara T, Craigie R. Retroviral DNA integration directed by HIV integration protein in vitro. Science 1990; 249:1555-1558.
25. Bushman FD, Craigie R. Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: Specific cleavage and integration of HIV-1 DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88:1339-1343.
26. Engelman A, Mizuuchi K, Craigie R. HIV-1 DNA integration: Mechanism of viral DNA cleavage and strand transfer. Cell 1991; 67:1211-1221.
27. Ho DD, Moudgil T, Alam M. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in the blood of infected persons. N Engl J Med 1989:321:1621-1625.
28. McCune MJ. HIV-1: The infective process in vivo. Cell 1991; 64:531-563.
29. Kim S, Byrn R, Groopman J. Baltimore D. Temporal aspects of DNA and RNA synthesis during human immunodeficiency virus infection: Evidence for differential gene expression. J Virol 1989:63:3708-3713.
30. Pomerantz RJ, Trono D. Feinberg MB. Cells non productively infected with HIV-1 exhibit an aberrant pattern of viral RNA expression: A molecular model for latency. Cell 1990; 61:1271-1276.
31. Cullen BR. Human immunodeficiency virus is a prototypic complex retrovirus. J Virol 1989:65:1053-1056.
32. Cullen BR. The HIV-1 Tat protein: An RNA sequence specific procesivity factor? Cell 1990; 63:655-657.
33. Feinberg MB, Jarrett RF, Aldovini A. HTLV-III expression and production involve complex regulation at the levels of splicing and translation of viral RNA. Cell 1986; 46:807-817.
34. Cullen BR. Green WC. Regulatory pathways governing HIV-1 replication. Cell 1989:58:423-426. 35. Cullen BR, Green WC. Functions of the auxiliary gene products of the human immunodeficiency virus type 1. Virology 1990; 178:1-5
36. Stevenson M, Zhang XH. Volsky DJ. Down-regulation of cell surface molecules during noncytopathic infection of T cells with human immunodeficiency virus. J Virol 1987; 61:3741-3748.
37. Kerkau T, Schmitt-Landgraf R, Schimpli A. Wecker E. Down-regulation of HLA class I antigens in HIV-1 infected cells. AIDS Res Human Retroviruses 1989:5:613-620.
38. Zeda F, Rosenberg, S Fauci A. Immunopathogenesis of human immunodeficiency virus infection. En: Koff WC, Wong- Staal F, Kennedy RC, ed. AIDS research reviews. Nueva York: Marcel Dekker, Inc., 1991:1:65-85.
39. Zhu T, Molt, Wang N. Genotypic and phenotypic characterization of HIV-1 in patients with primary infection. Science 1993; 261:1179-1181.
 40. Chesebro B, Wehrly K, Nishio J, Perryman S. Macrophagetropic human immunodeficiency virus isolates from different patients exhibit unusual V3 envelope sequence homogeneity in comparison with T-cell tropic isolates: Definition of critical aminoacids involved in cell tropism. J Virol 1992; 66:6547-6554.
41. Shioda T, Levy JA, Cheng-Mayer C. Small aminoacid changes in the V3 hypervariable region of gp120 can affect the T-cell line and macrophage tropism of human immunodeficiency virus type 1. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:9434-9438.
42. Hwang SS, Boyle TJ, Lyerly HK, Cullen BR. Identification of the envelope V3 loop as the primary determinant of cell tropism in HIV-1. Science 1991; 253:71- 74.
43. Fenyo EM, Norrby E. Biological variation of human immunodeficiency viruses and evolution of the late pathogenic infection in vivo. En: Koff WC, Wong-Staal F, Kennedy RC, ed. AIDS research reviews. Nueva York: Marcel Dekker Inc., 1991; 1:149-164.
44. Javaherian K, Langlois AJ, McDanal C. Principal neutralizing domain of the human immunodeficiency virus type I envelope protein. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:6768-6772.
45. Grimalia R, Fuller BA, Rennert PD, Nelson MB, Hammarskjold ML, Potts B et al. Mutations in the principal neutralization determinant of human immunodeficiency virus type 1 affect syncytium formation, virus infectivity, growth kinetics, and neutralization. J Virol 1992; 66:1875- 1883.
46. Takahashi H, Nakagawa Y, Pendleton CD, Houghten RA, Yokomuro K. Germain RN et al. Induction of broadly cross- reactive cytotoxic T cells recognizing an HIV-1 envelope determinant. Science 1992; 255:333-336.
47. Rusche JR, Javaherian K, McDanal C. Antibodies that inhibit fusion of human immunodeficiency virus-infected cells bind a 24 aminoacid sequence of the viral envelope gp120. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85:3198-3202.
48. Palker TJ, Clark ME, Langlois AJ. Type-specific neutralization of the human immunodeficiency virus with antibodies to env-encoded synthetic peptides. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85:1932-1936.
49. Goudsmit J, Debouck C, Melcen RH. Human immunodeficiency virus type 1 neutralization epitope with conserved architecture elicit early type-specific antibodies in experimentally infected chimpanzees. Proc Natl Acad Sci USA 1988:85:4478-4482.
50. Javaherian K, Langlois AJ, LaRosa GJ. Broadly neutralizing antibodies elicited by the hypervariable neutralizing determinant of HIV-1. Science 1990; 250:1590-1593.
51. Putney SD, LaRosa GJ, Prify AT. HIV-1 neutralization determinants. En: Koff WC, Wong-Staal F, Kennedy RC, ed. AIDS research reviews. Nueva York: Marcel Dekker Inc., 1991:385-402.
52. Takahashi H, Takeshita T, Morein B. Induction of CD8+ cytotoxic T cells by immunization with purified HIV-1 envelope proteins in ISCOMs. Nature 1990; 344:873-875. 53. Jackson D, Hayden J, Quirke P. Extraction of nucleic acid from fresh and archival material. En: McPherson Quirke P, Taylor G, ed. PCR: A practical approach. Nueva York: Oxford University Press, 1991:29-49.
54. Goudsmit J, Geelen J, Keulen W. Characterization of the African HIV-1 isolate CBL-4 (RUT) by partial sequence analysis and virus neutralization with peptide antibody and antisense phosphate methylated DNA. AIDS 1990; 4:559-564.
55. Ratner L, Haseltine W, Patarca R. Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III. Nature 1985; 313:277-284.
56. Sambrook J, Fritsch EF. Gel electrophoresis of DNA. En: Nolan C, ed. Molecular cloning a laboratory manual. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; 1:662.
57. Myers G, Korber B, Wain-Hobson S, Smith RF, Paulakis GN. Human retrovirus and AIDS. Los Alamos: Los Alamos National Laboratory, 1993.

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