Salud Pública de México

FENOTIPIFICACIÓN INMUNOLÓGICA DE LINFOCITOS EN PACIENTES VIH+(*) (*) Nota del editor: El título completo de este trabajo es "Fenotipificación inmunológica: la medición de los ángulos que forman la unión de los puntos correspondientes a las proporciones de linfocitos CD4+/CD8+, CD4+/CD3+ y CD8+/CD3+ en pacientes VIH+, como una forma para reducir la variabilidad analítica".

FENOTIPIFICACIÓN INMUNOLÓGICA DE LINFOCITOS EN PACIENTES VIH+(*) (*) Nota del editor: El título completo de este trabajo es "Fenotipificación inmunológica: la medición de los ángulos que forman la unión de los puntos correspondientes a las proporciones de linfocitos CD4+/CD8+, CD4+/CD3+ y CD8+/CD3+ en pacientes VIH+, como una forma para reducir la variabilidad analítica".

AUTORES


FRANCISCO JAVIER ALVARADO-ALEMAN, M.C., M. EN C. (1) JESUS KUMATE-RODRIGUEZ, M.C., DR. EN C. (2)

(1) Laboratorio de Citometría de Flujo. Departamento de Inmunoquímica, Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (INDRE). Secretaría de Salud, México.
(2) Cuando se elaboró este trabajo, Secretario de Salud, México. Actualmente, Investigador del Instituto Mexicano del Seguro Social.

RESUMEN

Se estudiaron los linfocitos CD3+, CD4+ y CD8+ de 187 pacientes que viven con el VIH-1, con edades comprendidas entre 19 y 56 años, en estadios clínicos A 1, 2, 3 (67 asintomáticos) y con SIDA en estadios B 1, 2, 3 y C1, 2, 3 (83 pacientes). Se usó un equipo compacto que utiliza sangre total y obvia la biometría hemática, ahorrando tiempo y costo. Al compararlos con 37 sujetos normales de las mismas edades, se encontró una marcada diferencia con los testigos de 1.78 ± 0.65 y con el grupo asintomático A 1, 2, 3 de 0.37 ± 0.23, al analizar las proporciones CD4+/CD8+ (ANOVA, F= <5%, >1%). Extendimos nuestra observación al análisis de los ángulos formados por la unión de los puntos de las proporciones CD4+/CD8+-CD4+/CD3+ y CD4+/CD3+-CD8+/CD3+ en papel milimétrico, a una distancia de 4 cm, graficando con el 0 a la izquierda y los 90 hacia arriba. El ángulo de las proporciones CD4+/CD3+- CD8+/CD3+ para los testigos fue de 199.59 ± 10.87 , comparado con el grupo de asintomáticos que fue de 140.59 ñ14.39 (ANOVA, F=<5%, >1%). El sobreponer en forma de diagrama los valores de los ángulos de las proporciones, tanto de los testigos como de los grupos problema en un círculo, facilita la interpretación al clínico.


ABSTRACT

We propose that the ratios of lymphocyte subsets: CD4+/CD8+, CD4+/CD3+, and CD8+/CD3+, graphically displayed in this order, could be an easy way of immunophenotyping and a simple form of interpretation both for clinicians and patients. A total of 187 asymptomatic HIV-positive patients, -including 83 symptomatic patients with AIDS- and a normal comparative age group of 36 patients, were studied by flow cytometry. Ratios were graphically displayed on millimetric-grid paper, and a specific point was given to each obtained ratio. The points were connected by a line. The angles formed by the lines were measured and graphically displayed over a circle. The point of reference 0 was located on the left side of the circle, giving the corresponding 90 , 180 , and 240 angles. The graph of the control group shows a "beach chair" image. As soon as the CD4+ lymphocytes diminish and the CD8+ lymphocytes increase in HIV+ patients, "the chair's headrest" descends and the "chair's footpiece " swivels back. Given the ranks and fluctuations of the lymphocyte subsets, their graphic display provides a better representation of the immunological status.


Introducción

El Manejo Médico de sujetos infectados por VIH-1, se basa en el conteo de los linfocitos que contienen una proteína de importantes funciones dentro del sistema inmune. Esta molécula es un receptor para el VIH-1, por lo que hace al linfocito su blanco de ataque y es denominada CD4+ (Clusters of Differentiation).1 

Una serie de estudios indican que los niveles circulantes de los linfocitos CD4+ tienen un importante significado pronóstico y terapéutico en pacientes infectados con el VIH-1. 2-7 La progresión al SIDA y un riesgo mayor de neumonía por Pneumocystis carinii se aprecia en pacientes con niveles menores de 200 CD4+/ul. 1 Para ensayos clínicos, el uso de antivirales se indica cuando los niveles de linfocitos CD4+ son menores a 500/ul, tomándose la decisión para iniciar un tratamiento antiretroviral.8 

El conteo más popularizado es aquel relacionado con la medición de células por æl de sangre, por medio de la técnica de fenotipificación por citometría de flujo de rayo láser.3,6

En el presente trabajo proponemos el uso de un equipo compacto, simple, que utiliza sangre total y no requiere de efectuar biometría hemática, lo que disminuye la variabilidad analítica.

Además, proponemos una nueva forma de expresar los resultados, donde se utilizan los datos obtenidos de las proporciones de los linfocitos CD4+/CD8+, CD4+/CD3+ y CD8+/CD3+, en este orden, para integrar un diagrama. Al unir los puntos de cada una y medir los ángulos correspondientes, el clínico podrá apreciar fácilmente, en un círculo, qué tan cerca o lejos se encuentra su paciente, al compararse tanto con el grupo de asintomáticos como con el de los que tienen SIDA.

Material y Métodos

Grupos en estudio. Se valoraron las subpoblaciones de linfocitos de 36 sujetos sanos voluntarios de ambos sexos. así como todas aquellas muestras sanguíneas, sin exclusión, de pacientes en edades comprendidas entre 20 y 55 años en diferentes estadios clínicos, con diagnóstico clínico y de laboratorio compatibles con VIH+, que fueron enviadas al laboratorio en un lapso de tres meses, acumulándose un total de 175 muestras. La clasificación clínica se hizo de acuerdo con lo establecido internacionalmente.2

Citometría de flujo de rayo láser. Se efectuó de acuerdo con las reglas de seguridad y técnicas internacionalmente establecidas.3,9,10 Se tomaron 5 cc de sangre total en tubos con EDTA como anticoagulante (Becton-Dickinson Vacutainer Systems, Rutherford N.J.). El equipo utilizado fue un FACSCount (Becton-Dickinson, México) de primera generación, que funciona con un láser de helio-neón con excitación a 543.5 nM, con sistema automático de análisis de la muestra. El ensayo completo requirió únicamente un par de tubos de reactivos CD4+ (marcados con ficoeritrina)/CD3+ (marcados con cyficoeritrina) y CD8+ (ficoeritrina/CD3+ cyficoeritrina). El control del equipo se hizo con las partículas provistas en el estuche con cuatro concentraciones (0, 50, 250 y 1 000 partículas), para hacer la curva con una muestra control, que se efectuó a diario. 10,11 Se adaptaron los comandos de la computadora integrada en el equipo para análisis automático de las muestras, de los siguientes parámetros: cuenta absoluta por æl de CD4+ (cooperadores) y CD8+ (supresores/citotóxicos), cuenta total de CD3+ (linfocitos T) y las proporciones de CD4+/CD8+, CD4+/CD3+ y CD8+/CD3+, en ese orden. Análisis de los ángulos de unión de las proporciones CD4/CD8, CD4/CD3 o CD8/CD3. Se graficaron los resultados de las proporciones en forma individual para cada paciente. En papel milimétrico se marcó en el centro de la línea correspondiente a las proporciones CD4+/CD3+, a 4 cm a la izquierda la línea de CD4+/CD8+ y a 4 cm a la derecha la correspondiente a CD8+/CD3+. Se graficaron en los extremos las proporciones iniciando de arriba a abajo con 3.0, 2.0, 1.0 y 0.0 en la base, con 5 cm de diferencia cada intervalo. En total un cuadrilátero de 8 x 15 cm.

Los puntos de las proporciones CD4+/CD8+, CD4+/CD3+ y CD8+/CD3+ obtenidas de cada paciente, se colocan en la línea correspondiente. Se unen los puntos y se miden los ángulos, con un transportador (BACO 5 200) tomando como el centro del círculo el punto de la proporción correspondiente a CD4+/CD3+. Los 0 se tomaron a la izquierda y los 90 hacia arriba, dejando los 180 a la derecha y los 270 hacia abajo como se aprecia en el círculo superior de la figura 1.

Resultados

En el cuadro I se pueden apreciar los resultados, en promedio ñ desviaciones  estándar (DE),  de los  números absolutos  de CD4+, CD3+,  y  CD8+, respectivamente.  Los  CD4+  disminuyen gradualmente, conforme los  pacientes están clínicamente  más comprometidos, como era  de esperarse. Se  aprecian los  CD3+ con desviaciones estándar  amplias y  sin diferencias  claras entre los grupos. A la inversa de los CD4+, los CD8+ aumentan inmediatamente en  el  grupo  asintomático A  1,  2,  3.  Una diferencia acentuada, también  característica, se aprecia  al valorar la proporción CD4+/CD8+, en  la misma tabla en  donde el análisis  de varianza 12  (ANOVA)  proporcionó una  F  de Snedecor de 346.35 ó 5%, > 1% al comparar los testigos vs  el grupo próximo de pacientes VIH+ asintomáticos A, 1, 2, 3.



En el mismo cuadro se muestran los resultados de los  ángulos  obtenidos en las  proporciones resultado de  la unión de  los puntos de las  proporciones CD4+/CD8+, CD4+/CD3+,  CD8+/CD3+, respectivamente. En estas  mediciones propuestas, se  aprecia también la clara diferencia entre el grupo testigo y el grupo VIH+  asintomático  A  1,   2,  3  donde   el  ANOVA  no   es significativo a <5% en el ángulo CD4+/CD8+, CD4+/CD3+. Por el contrario, el ángulo  CD4+/CD3+, CD8+/CD3+ muestra  una F  de 2020 5%, >1% al  comparar el grupo  testigo con  el grupo  de pacientes VIH+ asintomático  A 1,  2, 3.  En la  figura 1  se aprecia que los pacientes de  los grupos asintomáticos y  con SIDA forman un grupo compacto, separándose ampliamente de  la proporción CD4+/CD3+. En el círculo, la proporción  CD4+/CD8+ tiende a acercarse a 0  conforme avanzan en la enfermedad. La diferencia encontrada al ANOVA en el ángulo de la  proporción CD8+/CD3+, se aprecia mejor en  este diagrama donde tiende  a elevarse debido al aumento de CD8+.

 

Discusión

Debido a la variedad de rangos de los linfocitos, en general es muy difícil hacer un análisis adecuado de cada paciente, así como entre laboratorios por la gran cantidad de fuentes de variabilidad.5,9,13,14 Por otro lado las recomendaciones emitidas por otros grupos, por ejemplo, las del Centro para el Control de Enfermedades (Center for Disease Control) de Atlanta, EUA, no han sido internacionalmente aceptadas por los expertos mundiales en citometría de flujo.15 La ventaja de utilizar el FACSCount radica en obviar el efectuar una biometría hemática, lo que reduce la variabilidad analítica y el costo.10,11 Los hallazgos de este estudio muestran claramente que hay otra forma de presentación de resultados de inmunotipificación, la cual, aunque sui generis, permite al clínico valorar en una forma rápida y práctica qué tan cerca o lejos está su paciente de los otros estadios clínicos con SIDA establecido (B 1, 2, 3, C 1, 2, 3 y D 1, 2, 3).2 Este último grupo no estuvo presente en la muestra presentada aquí, debido a que se manejaron básicamente pacientes ambulatorios.

Las diferencias encontradas en las proporciones CD4+/CD3+ y en el desplazamiento de CD8+/CD3+. entre los grupos testigos y el A 1, 2, 3 asintomáticos, son debidas a que solicitan el estudio en etapas avanzadas.

La gran variabilidad de los rangos en los testigos a comparar y en enfermos, así como en las diferentes técnicas empleadas, donde es necesario hacer una biometría hemática, aumenta la variabilidad analítica. En parte por lo anterior, el grupo de pacientes VIH+ asintomáticos clasificados como A1 (>500 CD4+/æl), A2(>499-200 CD4+/æl) y A3 (< de 200 CD4+/æl) son los más vulnerables a ser expuestos a un tratamiento retroviral, así como a profilaxis antituberculosa o anti Pneumocystis carinii, ya que cuando se valoran solamente las cuentas absolutas de CD4+ entre grupos, las DE se sobreponen como se apreció en este estudio.

Por el contrario, con la valoración propuesta aquí, se muestra una F mayor que la de la valoración en proporciones CD4+/CD8+ comúnmente utilizada (2020 vs 346); así, se puede fácilmente apreciar, sobre todo al valorar el ángulo CD4+/CD3+, CD8+/CD3+, si hay o no un acercamiento a los grupos que presentan SIDA. En forma individual con el testigo, es muy fácil ver dónde se encuentra el paciente en la gráfica. Cada vez se da más importancia a las subpoblaciones CD8+16, y la propuesta hecha aquí implica una imagen de los linfocitos T y sus subpoblaciones en concierto.

Quedan estudios por efectuar, relacionados con los valores predictivos para el grupo B 1, 2, 3.

Por otro lado, consideramos que esta valoración puede ser aplicada en todos los laboratorios independientemente del equipo de citometría de flujo de rayo láser que utilicen, siempre y cuando se les proporcione el estadio clínico de los pacientes. Es recomendable que los testigos presenten siempre el patrón normal considerado; es decir, números mayores a menores en forma decreciente de CD3+, CD4+ y CD8+, en ese orden. Consideramos que una ventaja para el paciente es que se le informe -dada la gran variabilidad en la inmunofenotipificación-, en una forma gráfica, y no con un número específico, que está fuera de un valor real por la variabilidad normal. Este punto es importante, debido a la depresión que conlleva la cifra para el paciente.

También será necesario valorar niños, los cuales debido a su variabilidad y aumento de células, forman un capítulo aparte. 17

AGRADECIMIENTOS 

Al doctor José Luis Valdespino Gómez, Director del INDRE-SSA, por su apoyo institucional. A las químicas Luz María Espinoza y Carolina Soto, así como a la bióloga Maribel Puebla Amador, por su apoyo técnico, y  al doctor Alejandro Ruiz  Argelles, por su crítica al manuscrito.

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