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Enviar un correo electrónico al autor/a (Inicie sesión) A 142 pacientes se les realizó ELISA, Inmuno blot de IgG, Inmuno blot de IgA, (en los menores de 24 meses), determinación de antígeno en plasma, aislamiento viral por cultivo y detección de genoma viral por amplificación con la reacción de polimerasa en cadena (PCR). El diagnóstico integral demostró que 10% (14 pacientes) que resultaron negativos o indeterminados para detección de anticuerpos IgG anti-VIH-1, estaban infectados por el virus. Once de estos pacientes tienen entre 2 y 24 meses de edad; dos, entre 4 y 6.5 años, y uno, 30 años. El diagnóstico se emitió en cuatro de los casos por presencia de antígeno en plasma; en cinco por amplificación por PCR de ADN proviral presente en células mononucleares periféricas; en cuatro casos por PCR positivo e inmunofluorescencia (IF) del cultivo, y el último caso, presentó Inmuno blot positivo e IF del cultivo. Dichos casos presentan el problema de resultados falsos negativos por serología de anticuerpos anti-VIH, especialmente en niños menores de 24 meses.
Palabras clave: VIH; tests inmunológicos; diagnósticos perinatal; reacciones falso negativas; México
Comprehensive HIV diagnosis of 142 patients was done by ELISA, IgG immunoblot, IgA immunoblot (in patients under 24 months), plasma antigen determination, viral isolation by culture and genome detection by polymerasa chain reaction (PCR) amplification. Results showed that 14 patients (10%) with negative or indefinite results for anti-HIV-1 IgG antibody were in fact infected by the virus. Eleven of these patients were between 2 and 24 months of age, two between 4 and 6.5 years and one was 30 years old. Diagnosis was obtained by antigen positivity in four of them; by PCR amplification of peripheral mononuclear cells of proviral DNA in five of them; by PCR and immunofluorescence (II) of cultured cells in four cases, and the last diagnosis was made by IgG immunoblot and IF of the viral culture. These cases pose a problem because of false negative HIV serology, particularly in patients under 24 months of age.
Key words: HIV; immunological tests: perinatal diagnosis: false negative reactions. Mexico
Solicitud de sobretiros: Q.F.B. Carmen Soler Claudín. Apartado Postal 70-228. 04310 México, D.F.
DE MODO TRADICIONAL se considera que un individuo que dé resultados negativos en pruebas de detección de anticuerpos anti VIH-1, no se encuentra infectado con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Son pocos los informes de individuos que permanecen seronegativos por largos periodos y, en general, se trata de parejas de individuos seropositivos.
Los datos epidemiológicos muestran una tendencia ascendente de la transmisión heterosexual en mujeres en edad fértil. Si se toma en cuenta que la eficiencia de transmisión de madres a hijos varía entre 20 y 50%, según diferentes estudios.1-4 es lógico suponer que el número de casos de infección perinatal se elevará de modo considerable en los próximos años, tal como lo demuestran las tendencias de casos de SIDA pediátrico por esta vía de transmisión, que presentan un aumento de 55% en 1990, a 61% en 1993, y a 81.2% en 1994,5 imponiendo una seria demanda de diagnóstico perinatal adecuado.
El diagnóstico de infección por VIH en niños menores de 24 meses, nacidos de madres seropositivas, presenta dificultades especiales. La serología tradicional no ofrece garantías diagnósticas, puesto que los anticuerpos de tipo IgG detectados con los métodos empleados en el diagnóstico regular pueden ser positivos, pero frecuentemente corresponden a anticuerpos maternos transferidos in utero y no a infección del producto.6-7
Por esta razón, se hace necesario demostrar la presencia de anticuerpos anti-VIH tipo IgM o IgA, que no atraviesan la placenta, o bien, del agente etiológico de esta infección. Para demostrar la presencia del virus, se puede realizar su aislamiento o demostrar la presencia de sus componentes, que pueden ser sus proteínas (determinación de antígenos virales) o su material genómico (ADN proviral integrado en las células infectadas, o ARN viral presente en el plasma). Un resultado positivo en cualquiera de estos parámetros se considera suficiente para diagnosticar como infectado a un paciente.
El análisis de estas metodologías muestra que la más sencilla y económica es la detección de antígeno en plasma, puesto que existen ensayos de disponibilidad comercial y bien estandarizados. Sin embargo, la historia natural de la enfermedad demuestra que el antígeno se encuentra presente, en concentraciones variables, aun en pacientes con síntomas; y que en individuos infectados pero asintomáticos, por lo común no es detectable con la metodología existente.7 Así, la sensibilidad de este método llega a ser muy variable. También hay informes de algunos resultados falsos positivos al determinar antígeno, sobre todo en niños menores de dos meses de edad.
Otros estudios recientes informan la detección de anticuerpos tipo IgA, y/o tipo IgM en plasma, como método alternativo en el diagnóstico perinatal de VIH. Los resultados publicados indican que, si se efectúa absorción de las inmunoglobulinas tipo IgG presentes en la muestra, la detección de anticuerpos tipo IgA alcanza valores de sensibilidad entre 66 y 83%.8-10
El aislamiento viral, considerado hasta el momento como la prueba definitiva de infección por VIH, no estaba suficientemente bien estandarizado hasta hace unos años y la efectividad del método era muy baja (se aislaba virus de aproximadamente 70% de los pacientes infectados). En la actualidad, esta metodología alcanza una efectividad cercana al 100% y es la que produce mejores resultados si se consideran en conjunto los obtenidos en todas las edades, incluyendo recién nacidos.11 No obstante, un gran inconveniente de este método es que pocos laboratorios en el mundo lo llevan a cabo y, en general, son laboratorios especializados, dedicados a la investigación, con instalaciones de alta seguridad biológica; además, por su costo no es una metodología aplicable en un alto número de muestras.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) promete ser uno de los métodos de elección para este tipo de diagnóstico.12 Contrariamente a la determinación de antígeno, permitiría la detección en cualquier etapa de la infección siempre y cuando la estandarización y el control de calidad de su aplicación asegure la validez de los resultados obtenidos. Todavía no es un método disponible comercialmente, sin embargo, es susceptible de ser implantado en diversos laboratorios a un costo mucho menor que el aislamiento viral.
Sumado a estas dificultades, en este trabajo reportamos los datos de 14 de 142 casos estudiados, en que las pruebas serológicas son negativas y los pacientes han sido confirmados como infectados por el VIH empleando otras metodologías como PCR, cultivo o determinación de antígenos virales en plasma. Once de estos pacientes corresponden a niños menores de 24 meses.
Se estudiaron 142 pacientes, de los cuales se obtuvo una muestra de sangre completa colectada con anticoagulante, que fue sometida a un gradiente de ficoll-hypaque, separándose el plasma y las células mononucleares periféricas (CMP). Todas las muestras fueron sometidas a ELISA para anticuerpos anti-VIH, detección de antígeno en plasma, Inmuno blot de IgG y,en los casos de menores de 24 meses, Inmuno blot de IgA. En la mayoría de ellos se realizó cocultivo de CMP, seguido por determinaciones semanales de antígeno en sobrenadantes y por inmunofluorescencia de células fijas cada dos semanas, y/o PCR de CMP originales, y/o PCR de los cocultivos celulares.
Las muestras de plasma fueron procesadas en el Laboratorio de Enfermedades de Transmisión Sexual del Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (ETS/INDRE), para la búsqueda de anticuerpos anti-VIH-1 por dos ensayos inmunoenzimáticos comerciales, según las instrucciones contenidas en los estuches respectivos.
Para determinar la respuesta inmune de los pacientes a proteínas virales específicas, se hicieron ensayos de Inmuno blot para IgG (IB-IgG) empleando tiras de nitrocelulosa- (NC) con antígeno proveniente de virus prototipo HTLV IIIb/LAV, preparadas en nuestro laboratorio de acuerdo con la metodología previamente reportada.13-15 Para el Inmuno blot de IgA (IB-IgA) se utilizó básicamente el método de Landesman y colaboradores.16
También se efectuó detección de antígeno empleando el ensayo inmunoenzimático de captura de antígeno (HIVAG-1 Abbott Laboratories), siguiendo las instrucciones marcadas por el fabricante. Este mismo estuche fue empleado para detectar la presencia de virus en los sobrenadantes de los cocultivos establecidos para posible aislamiento.17
En las muestras que resultaron negativas a antígeno en plasma, se practicó la modificación de rompimiento de complejos antígeno-anticuerpo por tratamiento con ácido, según reportes de Nishanian y Palomba.13
Las CMP obtenidas por centrifugación de la sangre heparinizada en gradientes de Ficoll, se cocultivaron en relación 1:1 con CMP obtenidas de individuos VIH-1 y Hepatitis B negativos (proporcionadas por el Centro de Transfusión Sanguínea en forma de concentrados leucocitarios), preactivadas por 48-72 horas con fitohemaglutinina (PHA; 5 µg/ml, Sigma Co.) y tratadas por 30 min con polibren (concentración final 2 ug/ml, Sigma Co.). Los cocultivos se mantuvieron en medio RPMI-1640, suplementado con 20% de suero fetal bovino, 1% de mezcla de antibióticos-antimicóticos (todos ellos de Gibco) y 50 U/ml de Interleucina-2 recombinante (Sigma Co.).17
El medio se cambió dos veces por semana, examinando microscópicamente los cultivos para observar la aparición de efecto citopático. Una vez por semana se realizó la determinación de antígeno en el sobrenadante e inmunofluorescencia de células fijadas (IF) cada dos semanas.19 Los cultivos se alimentaron con CMP de donadores negativos, preactivadas con PHA. Se consideraron negativos aquellos cultivos que no produjeron antígeno por seis semanas, y positivos aquéllos con, por lo menos, dos valores positivos a antígeno secuenciales.
Entre uno y 10 millones de CMP obtenidas directamente del gradiente de Ficoll, o de los cocultivos celulares, se digirieron con proteinasa K. El ADN se purificó mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol/acetato de sodio. La concentración de ADN obtenida se determinó por espectrofotometría a 260 nm. Las muestras fueron sometidas a amplificación, empleando un par de oligonucleótidos que abarcan una región conservada del gen gag de VIH-1 de 142 pares de bases: SK 145/SK 431 (Perkin Elmer) y/u otro par de iniciadores que amplifican la región variable 3 del gen env de VIH-1 de 320 pares de bases(KSI-3'/KSI-5').Con ambos pares de oligonucleótidos se emplearon 35 ciclos de amplificación (95 C 1'; 55 C 1'; y 72 C 2'), bajo las siguientes condiciones: KC150 mM; Tris-HC1 10 mM pH 8.3; Mg Cl-2+ 1.5 mM; 50 pmoles de cada oligonucleótido y 1.5 U de taq-ADN polimerasa. Como controles de la reacción en cada ensayo se amplificaron simultáneamente: como control positivo ADN del virus prototipo HTLV-IIIb/LAV, y como control negativo ADN de células linfocíticas no infectadas o ADN de linfocitos de individuos negativos a VIH-1. También, en cada ensayo se incluyó un control de reactivos (sin ADN) para asegurar que no se presentara un problema de contaminación.12 El producto de amplificación se identificó por electroforesis en geles de agarosa 2.5%, teñidos con bromuro de etidio o de acrilamida 7%, teñidos con nitrato de plata, detectándose la aparición de una banda del tamaño esperado. Se utilizaron en cada gel marcadores de peso molecular de GIBCO. La identidad del producto de amplificación se confirmó por digestión con enzimas de restricción y observación de las bandas esperadas, o por hibridación con una sonda específica marcada con biotina y revelando con quimioluminiscencia.
Al analizar los datos de los 142 pacientes estudiados, se encontró que 14 de ellos que habían resultado negativos por ELISA, se confirmaron como infectados por alguna otra metodología específica.
En el cuadro I se presentan los datos para todos los ensayos realizados en cada una de estas muestras. Puede observarse que los datos de edad, indican que 11 de estos pacientes son niños de entre 2 y 24 meses, con una media de 13 meses; dos pacientes tienen entre 4 y 6.5 años, y la otra muestra corresponde a una mujer de 30 años, madre de uno de los niños estudiados.
Cinco de los 14 pacientes ELISA negativos presentan un Inmuno blot indeterminado, tres de ellos son positivos y seis negativos a esta prueba. Sólo el paciente 128 presenta Inmuno blot de IgA positivo.
El diagnóstico de infección fue emitido en cuatro de los pacientes por presencia de antígenos virales en plasma; en cinco por PCR positivo en CMP, en cuatro casos por PCR positivo e inmunofluorescencia positivosdel cocultivo. En el caso del paciente adulto, se obtuvo Inmuno blot positivo e IF de las células del cocultivo.
Los resultados de los 142 pacientes, en los cuales se realizó un diagnóstico integral, muestran que en 10% de ellos la serología, por sí misma, no resuelve el diagnóstico de individuos infectados por el VIH Las posibles explicaciones a este fenómeno son varias: desde una probable inmunodeficiencia muy marcada en dichos pacientes -que pueda deberse ya sea a inmadurez del sistema inmune o a un gran deterioro del mismo-, hasta la posibilidad de que, debido al mecanismo de infección de estos pacientes, el virus del inóculo original se integre rápidamente al genoma celular, establezca latencia y no se exprese, evitando así la posible respuesta inmune del hospedero.
Es importante considerar estos resultados cuando se trate de definir el estado de infección, sobre todo en menores de 24 meses, ya que un resultado negativo en la serología podría significar que el médico considere a dicho paciente como no infectado sin que sea éste el caso. Con esta información se hace totalmente obligatorio realizar el diagnóstico a través de parámetros más específicos que la serología, o el seguimiento de los niños nacidos de madres seropositivas hasta por lo menos los 24-30 meses de edad, para asegurar que no se encuentran entre los casos aquí mencionados.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Q.F.B . Fernanda Martínez la realización de los ensayos de PCR, y a la Q.F.B. Angélica López Sotelo, del Laboratorio de Enfermedades de Transmisión Sexual del INDRE, la realización de las pruebas de ELISA de anticuerpos a VIH-1.
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