Salud Pública de México

UN PROBLEMA DE DIAGNÓSTICO PERINATAL: PACIENTES SEROLÓGICAMENTE NEGATIVOS PERO INFECTADOS POR EL VIH

UN PROBLEMA DE DIAGNÓSTICO PERINATAL: PACIENTES SEROLÓGICAMENTE NEGATIVOS PERO INFECTADOS POR EL VIH

AUTORES


CARMEN SOLER CLAUDIN, Q.F.B., M. EN C.(1) MARIA DEL CARMEN BASUALDO-SIGALES, Q.F.B (1)

(1) Unidad de Investigación en Retrovirus Humanos, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México e Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, Secretaría de Salud.

RESUMEN

A 142 pacientes se les  realizó ELISA, Inmuno blot de  IgG, Inmuno  blot  de  IgA,  (en  los  menores  de  24   meses), determinación de antígeno en plasma, aislamiento viral  por cultivo y detección de  genoma viral por amplificación  con  la reacción de polimerasa  en cadena (PCR). El  diagnóstico  integral demostró  que 10%  (14 pacientes)  que  resultaron negativos o  indeterminados para  detección de  anticuerpos IgG anti-VIH-1, estaban  infectados por el  virus. Once  de estos pacientes tienen  entre 2 y  24 meses  de edad;  dos, entre 4  y 6.5  años, y  uno, 30  años. El  diagnóstico  se emitió en cuatro de los casos por presencia de antígeno  en plasma; en cinco por amplificación por PCR de ADN  proviral presente en  células mononucleares  periféricas; en  cuatro casos por  PCR  positivo  e  inmunofluorescencia  (IF)  del cultivo, y el último caso, presentó Inmuno blot positivo  e IF del  cultivo.  Dichos  casos presentan  el  problema  de resultados falsos  negativos por  serología de  anticuerpos anti-VIH, especialmente en niños menores de 24 meses. 
 
Palabras  clave:  VIH;  tests  inmunológicos;  diagnósticos perinatal; reacciones falso negativas; México

ABSTRACT

Comprehensive HIV  diagnosis  of  142 patients  was  done  by ELISA, IgG immunoblot, IgA  immunoblot (in patients under  24 months), plasma  antigen  determination, viral  isolation  by culture and  genome detection  by polymerasa  chain  reaction (PCR) amplification. Results  showed that  14 patients  (10%) with  negative  or  indefinite  results  for  anti-HIV-1  IgG antibody were in fact infected by the virus. Eleven of  these  patients were between 2 and  24 months of age, two between  4 and 6.5  years  and  one was  30  years  old.  Diagnosis  was obtained by  antigen  positivity  in four  of  them;  by  PCR amplification of peripheral mononuclear cells of proviral DNA in five  of  them;  by PCR  and  immunofluorescence  (II)  of cultured cells in four cases, and the last diagnosis was made by IgG immunoblot and  IF of the  viral culture. These  cases pose a  problem  because  of  false  negative  HIV  serology, particularly in patients under 24 months of age.

Key words: HIV;  immunological tests: perinatal  diagnosis: false negative reactions. Mexico


Solicitud  de  sobretiros:  Q.F.B.  Carmen  Soler  Claudín. Apartado Postal 70-228. 04310 México, D.F.

Introducción

DE MODO  TRADICIONAL se  considera que  un individuo  que  dé  resultados negativos en pruebas  de detección de  anticuerpos anti VIH-1,  no  se  encuentra  infectado  con  el  virus  de inmunodeficiencia humana  (VIH). Son  pocos los  informes  de individuos que permanecen  seronegativos por largos  periodos y,  en   general,  se   trata   de  parejas   de   individuos seropositivos.

Los datos epidemiológicos  muestran una tendencia  ascendente de la transmisión heterosexual en mujeres en edad fértil.  Si se toma en cuenta que la eficiencia de transmisión de  madres  a hijos varía entre 20 y 50%, según diferentes estudios.1-4 es lógico  suponer  que  el  número  de  casos  de  infección perinatal se  elevará de  modo considerable  en los  próximos años, tal como lo demuestran las tendencias de casos de  SIDA pediátrico por  esta vía  de  transmisión, que  presentan  un aumento de 55% en 1990, a 61% en 1993, y a 81.2% en  1994,5 imponiendo  una  seria   demanda  de  diagnóstico   perinatal adecuado.

El diagnóstico de infección  por VIH en  niños menores de  24 meses, nacidos de madres seropositivas, presenta dificultades especiales. La  serología  tradicional  no  ofrece  garantías diagnósticas,  puesto  que  los   anticuerpos  de  tipo   IgG detectados  con  los  métodos  empleados  en  el  diagnóstico regular   pueden   ser    positivos,   pero    frecuentemente corresponden a anticuerpos maternos  transferidos in utero  y no a infección del producto.6-7

Por esta razón, se hace  necesario demostrar la presencia  de anticuerpos anti-VIH tipo  IgM o  IgA, que  no atraviesan  la placenta, o bien,  del agente etiológico  de esta  infección. Para demostrar la presencia del  virus, se puede realizar  su aislamiento o demostrar la presencia de sus componentes,  que pueden ser sus proteínas (determinación de antígenos virales) o su material genómico (ADN proviral integrado en las células infectadas, o ARN viral presente en el plasma). Un  resultado positivo en  cualquiera  de  estos  parámetros  se  considera suficiente para diagnosticar como infectado a un paciente.

El análisis de estas metodologías muestra que la más sencilla y económica es la detección de antígeno en plasma, puesto que existen  ensayos   de   disponibilidad   comercial y bien estandarizados.  Sin  embargo,  la  historia  natural  de  la enfermedad demuestra que el  antígeno se encuentra  presente, en concentraciones variables, aun en pacientes con  síntomas; y que  en individuos  infectados pero  asintomáticos, por  lo común no es detectable con la metodología existente.7 Así, la sensibilidad  de este  método llega  a ser  muy  variable. También hay informes de  algunos resultados falsos  positivos al determinar antígeno,  sobre todo en  niños menores de  dos meses de edad. 

Otros estudios recientes informan la detección de anticuerpos tipo IgA, y/o tipo IgM en plasma, como método alternativo  en el diagnóstico perinatal  de VIH.  Los resultados  publicados indican que, si se efectúa absorción de las  inmunoglobulinas tipo IgG presentes en la muestra, la detección de anticuerpos tipo IgA   alcanza    valores   de  sensibilidad entre  66  y 83%.8-10 

El aislamiento viral,  considerado hasta el  momento como  la prueba  definitiva de infección  por   VIH,   no   estaba suficientemente bien estandarizado hasta hace unos años y  la efectividad del  método era  muy baja  (se aislaba  virus de aproximadamente 70%  de  los  pacientes  infectados).  En  la actualidad, esta metodología alcanza una efectividad  cercana al 100%  y  es  la  que  produce mejores  resultados  si  se consideran en  conjunto los  obtenidos en  todas las edades, incluyendo  recién   nacidos.11  No  obstante,   un   gran inconveniente de este método es que pocos laboratorios en  el mundo lo  llevan  a  cabo y,  en general, son laboratorios especializados, dedicados a la investigación, con instalaciones de  alta seguridad  biológica; además,  por  su costo no es una metodología aplicable en  un alto número  de muestras. 
 
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) promete ser  uno de los métodos de elección para este tipo de diagnóstico.12 Contrariamente a la determinación de antígeno, permitiría  la detección en cualquier etapa de la infección siempre y cuando la estandarización y el control  de calidad de su  aplicación asegure la validez de los resultados obtenidos. Todavía no es un  método disponible comercialmente,   sin  embargo,   es susceptible de ser implantado en diversos laboratorios a  un costo mucho menor que el aislamiento viral.

Sumado a estas dificultades,  en este trabajo reportamos  los datos de  14 de  142  casos estudiados,  en que  las  pruebas serológicas  son   negativas  y   los  pacientes   han   sido confirmados  como  infectados  por  el  VIH  empleando  otras metodologías como PCR, cultivo  o determinación de  antígenos virales en  plasma. Once  de estos  pacientes corresponden  a niños menores de 24 meses. 

Material y Métodos

Se estudiaron 142 pacientes, de los cuales se obtuvo una muestra de sangre completa colectada con anticoagulante, que fue sometida a un gradiente de ficoll-hypaque, separándose el plasma y las células mononucleares periféricas (CMP). Todas las muestras fueron sometidas a ELISA para anticuerpos anti-VIH, detección de antígeno en plasma, Inmuno blot de IgG y,en los casos de menores de 24 meses, Inmuno blot de IgA. En la mayoría de ellos se realizó cocultivo de CMP, seguido por determinaciones semanales de antígeno en sobrenadantes y por inmunofluorescencia de células fijas cada dos semanas, y/o PCR de CMP originales, y/o PCR de los cocultivos celulares.

Las muestras de plasma fueron procesadas en el Laboratorio de Enfermedades de Transmisión Sexual del Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (ETS/INDRE), para la búsqueda de anticuerpos anti-VIH-1 por dos ensayos inmunoenzimáticos comerciales, según las instrucciones contenidas en los estuches respectivos.

Para determinar la respuesta inmune de los pacientes a proteínas virales específicas, se hicieron ensayos de Inmuno blot para IgG (IB-IgG) empleando tiras de nitrocelulosa- (NC) con antígeno proveniente de virus prototipo HTLV IIIb/LAV, preparadas en nuestro laboratorio de acuerdo con la metodología previamente reportada.13-15 Para el Inmuno blot de IgA (IB-IgA) se utilizó básicamente el método de Landesman y colaboradores.16

También se efectuó detección de antígeno empleando el ensayo inmunoenzimático de captura de antígeno (HIVAG-1 Abbott Laboratories), siguiendo las instrucciones marcadas por el fabricante. Este mismo estuche fue empleado para detectar la presencia de virus en los sobrenadantes de los cocultivos establecidos para posible aislamiento.17

En las muestras que resultaron negativas a antígeno en plasma, se practicó la modificación de rompimiento de complejos antígeno-anticuerpo por tratamiento con ácido, según reportes de Nishanian y Palomba.13

Las CMP obtenidas por centrifugación de la sangre heparinizada en gradientes de Ficoll, se cocultivaron en relación 1:1 con CMP obtenidas de individuos VIH-1 y Hepatitis B negativos (proporcionadas por el Centro de Transfusión Sanguínea en forma de concentrados leucocitarios), preactivadas por 48-72 horas con fitohemaglutinina (PHA; 5 µg/ml, Sigma Co.) y tratadas por 30 min con polibren (concentración final 2 ug/ml, Sigma Co.). Los cocultivos se mantuvieron en medio RPMI-1640, suplementado con 20% de suero fetal bovino, 1% de mezcla de antibióticos-antimicóticos (todos ellos de Gibco) y 50 U/ml de Interleucina-2 recombinante (Sigma Co.).17

El medio se cambió dos veces por semana, examinando microscópicamente los cultivos para observar la aparición de efecto citopático. Una vez por semana se realizó la determinación de antígeno en el sobrenadante e inmunofluorescencia de células fijadas (IF) cada dos semanas.19 Los cultivos se alimentaron con CMP de donadores negativos, preactivadas con PHA. Se consideraron negativos aquellos cultivos que no produjeron antígeno por seis semanas, y positivos aquéllos con, por lo menos, dos valores positivos a antígeno secuenciales.

Entre uno y 10 millones de CMP obtenidas directamente del gradiente de Ficoll, o de los cocultivos celulares, se digirieron con proteinasa K. El ADN se purificó mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol/acetato de sodio. La concentración de ADN obtenida se determinó por espectrofotometría a 260 nm. Las muestras fueron sometidas a amplificación, empleando un par de oligonucleótidos que abarcan una región conservada del gen gag de VIH-1 de 142 pares de bases: SK 145/SK 431 (Perkin Elmer) y/u otro par de iniciadores que amplifican la región variable 3 del gen env de VIH-1 de 320 pares de bases(KSI-3'/KSI-5').Con ambos pares de oligonucleótidos se emplearon 35 ciclos de amplificación (95 C 1'; 55 C 1'; y 72 C 2'), bajo las siguientes condiciones: KC150 mM; Tris-HC1 10 mM pH 8.3; Mg Cl-2+ 1.5 mM; 50 pmoles de cada oligonucleótido y 1.5 U de taq-ADN polimerasa. Como controles de la reacción en cada ensayo se amplificaron simultáneamente: como control positivo ADN del virus prototipo HTLV-IIIb/LAV, y como control negativo ADN de células linfocíticas no infectadas o ADN de linfocitos de individuos negativos a VIH-1. También, en cada ensayo se incluyó un control de reactivos (sin ADN) para asegurar que no se presentara un problema de contaminación.12 El producto de amplificación se identificó por electroforesis en geles de agarosa 2.5%, teñidos con bromuro de etidio o de acrilamida 7%, teñidos con nitrato de plata, detectándose la aparición de una banda del tamaño esperado. Se utilizaron en cada gel marcadores de peso molecular de GIBCO. La identidad del producto de amplificación se confirmó por digestión con enzimas de restricción y observación de las bandas esperadas, o por hibridación con una sonda específica marcada con biotina y revelando con quimioluminiscencia.

Resultados

Al analizar los datos de los 142 pacientes estudiados, se encontró que 14 de ellos que habían resultado negativos por ELISA, se confirmaron como infectados por alguna otra metodología específica.

En el cuadro I se presentan los datos para todos los ensayos realizados en cada una de estas muestras. Puede observarse que los datos de edad, indican que 11 de estos pacientes son niños de entre 2 y 24 meses, con una media de 13 meses; dos pacientes tienen entre 4 y 6.5 años, y la otra muestra corresponde a una mujer de 30 años, madre de uno de los niños estudiados.

Cinco de los 14 pacientes ELISA negativos presentan un Inmuno blot indeterminado, tres de ellos son positivos y seis negativos a esta prueba. Sólo el paciente 128 presenta Inmuno blot de IgA positivo.

El diagnóstico de infección fue emitido en cuatro de los pacientes por presencia de antígenos virales en plasma; en cinco por PCR positivo en CMP, en cuatro casos por PCR positivo e inmunofluorescencia positivosdel cocultivo. En el caso del paciente adulto, se obtuvo Inmuno blot positivo e IF de las células del cocultivo.

Discusión

Los resultados de los 142 pacientes, en los cuales se realizó un diagnóstico  integral, muestran  que en  10% de  ellos  la serología, por  sí  misma,  no  resuelve  el  diagnóstico  de individuos infectados por el VIH Las posibles explicaciones a este   fenómeno    son    varias:    desde    una    probable inmunodeficiencia muy marcada en dichos pacientes -que  pueda deberse ya sea  a inmadurez del  sistema inmune  o a un  gran deterioro del mismo-, hasta la posibilidad de que, debido  al mecanismo de  infección  de  estos pacientes,  el  virus  del inóculo original se  integre rápidamente  al genoma  celular, establezca latencia y no se exprese, evitando así la  posible respuesta inmune del hospedero.

Es importante considerar estos resultados cuando se trate  de definir el estado de infección,  sobre todo en menores de  24 meses, ya que  un resultado negativo  en la serología  podría significar que el médico considere  a dicho paciente como  no infectado sin que sea éste  el caso. Con esta información  se hace totalmente obligatorio realizar el diagnóstico a  través de  parámetros  más  específicos  que  la  serología,  o   el seguimiento de  los  niños nacidos  de  madres  seropositivas hasta por lo menos los 24-30 meses de edad, para asegurar que no se encuentran entre los casos aquí mencionados. 

AGRADECIMIENTOS 

Agradecemos a la Q.F.B . Fernanda Martínez la realización  de los ensayos de PCR, y a la Q.F.B. Angélica López Sotelo,  del Laboratorio de Enfermedades de Transmisión Sexual del  INDRE, la realización de las pruebas  de ELISA de anticuerpos  a VIH-1.

Bibliografía

1.Furlini GR, Ferranti G, Dalla Casa P, La Placa M. Serum antibody pattern, antigenemia and virus isolation in infants born to mother seropositive for human immunodeficiency virus. J Med Virol 1989;28:129-132.
2.Italian Multicenter Study. Epidemiology, clinical features, and prognostic factors of pediatric HIV infection. Lancet 1988;2:1043-1045.
3.Blanche S, Rouzioux C, Guichard-Moscato ML, the French Colaborative Study. A prospective study of infants born to women seropositive for human immunodeficiency virus type I. N Engl J Med 1989;320:1643-1648.
4.European Collaborative Study. Mother-to-child transmission HIV infection. Lancet 1988;1:1039-1042.
5.Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos. Situación del SIDA. Bol Mensual SIDA/ ETS 1994;8(7):2698.
6.Mok JQ, De Rossi A, Ades AE, Giaquinto C, Grosch Worner I, Peckham CS. Infants born to mothers seropositive for human immunodeficiency virus. Lancet 1987;1:1164-1167.
7.Borkowsky W, Krasinski K, Paul D, Holzman R, Moore T, Bebenroth D et al. Human immunodeficiency virus type 1 antigenemia in children. I Pediatr 1989;114:940-945.
8.Weiblen BJ, Schumacher RT, Hoff R. Detection of IgM and IgA antibodies to HIV-1 after removal of IgG with recombinant protein G. J Immunol Methods 1990;126: 199-204.
9.Quinn TC, Kline RL, Halsey N, Hutton N, Ruff A, Butz A et al. Early diagnosis of perinatal HIV infection by detection of viral-specific IgA antibodies. JAMA 1991;24:3439-3442.
10.Weiblen BJ, Lee FK, Cooper ER, Landesman SH, Mcintosh K, Harris JAS et al. Early diagnosis of HIV infection in infants by detection of IgA HIV antibodies. Lancet 1990;1:988-990.
11.Rogers MF, Ou CY, Killbourne B, Schochetman G. Advances and problems in the diagnosis of human immunodeficiency virus infection in infants. Pediatr Infect Dis J 1991;10:523-531.
12.Cassol SA, Lapointe N, Salas T, Hankins C, Arella M, Fauvel M et al. Diagnosis of vertical HIV-1 transmission using the polymerase chain reaction and dried blood spot specimens. J Acquir Immune Defic Syndr 1992;5: 113-119.
13.Travers K, Kanki Ph. HIV Antibody detection in serum. En: Aldovini A, Bruce Walker D, ed. Techniques in HIV research. Nueva York: Stockton Press, 1990:3-10.
14.Desrosiers RC. Virus purification, preparation of infectious virus stock, and virus storage. En: Aldovini A, Bruce Walker D, ed. Techniques in HIV research. Nueva York: Stockton Press, 1990:121-126.
15.Soler C, Basualdo MC, Martínez F. Diagnóstico perinatal de SIDA. Enferm Infecc Microbiol 1994;14(3):178-183.
16.Landesman Sh, Weiblen B, Méndez H, Willoughby A, Goedert J, Rubinstein A et al. Clinical utility of HIV-IgA in the early diagnosis of perinatal HIV infection. JAMA 1991;266:3443-3446.
17.Gartner S, Popovic M. Virus isolation and production. En: Aldovini A, Bruce Walker D, ed. Techniques in HIV research. Nueva York: Stockton Press, 1990:53-70.
18.Palomba E, Vincenzo G, Maurizio M. Early diagnosis of human immunodeficiency virus infection in infants by detection of free and complexed p24 antigen. J Infect Dis 1992;165:394-395.
19.Johnson VA, Byington RE. Quantitative assays for virus detection. En: Aldovini A, Bruce Walker D, ed. Techniques in HIV research. Nueva York: Stockton Press, 1990:87-91.

Enlaces refback





Salud Pública de México es una publicación periódica electrónica, bimestral, publicada por el Instituto Nacional de Salud Pública (con domicilio en Avenida Universidad núm. 655, col. Santa María Ahuacatitlán, Cuernavaca, Morelos, C.P. 62100, teléfono 329-3000, página web, www.insp.mx), con ISSN: 1606-7916 y Reserva de Derechos al Uso Exclusivo con número: 04-2012-071614550600-203, ambos otorgados por el Instituto Nacional del Derecho de Autor. Editor responsable: Carlos Oropeza Abúndez. Responsable de la versión electrónica: Subdirección de Comunicación Científica y Publicaciones, Avenida Universidad núm. 655, planta baja, col. Santa María Ahuacatitlán, Cuernavaca, Morelos, C.P. 62100, teléfono 329 3000. Fecha de última modificación: 7 de junio de 2018. D.R. © por el sitio: Instituto Nacional de Salud Pública.

Gestionando el conocimiento