Salud Pública de México

Mesa redonda XVINuevas vacunas contra Tb

Mesa redonda XVINuevas vacunas contra Tb

AUTORES

Rogelio Hernández-Pando(1)

(1) Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición “Salvador Zubirán”

Introducción

Resumen

Debido a la muy variable respuesta protectora que origina la vacuna BCG (bacilo de Calmette-Guérin), existe un esfuerzo mundial para elaborar vacunas nuevas y másmás efectivasque contribuyan a controlar mejor la tuberculosis. En general, existen cuatro estrategias para obtener nuevas vacunas más eficientes que la BCG, que son a) antígenos inmunodominantes (vacunas de subunidades), b) vacunas de ADN, c) BCG recombinantes y 4) micobacterias mutantes atenuadas. En este trabajo se describen de manera general algunos de los candidatos vacunales de cada una de estas estrategias que han resultado más eficientes en modelos experimentales, algunos de los cuales están ya en ensayos clínicos.

La tuberculosis es aún una de las principales causas de mortalidad en el mundo. La pandemia del SIDA, el deterioro de los sistemas de salud pública en los países en vías de desarrollo y el surgimiento de cepas resistentes a múltiples fármacos contribuyeron a agravar la situación mundial de la tuberculosis.1 En la actualidad, la única vacuna disponible para prevenir la tuberculosis en la población humana es la Mycobacterium bovis BCG (bacilo de Calmette-Guérinn), la cual se produjo al principio a partir de varios subcultivos de una cepa de M .bovis virulenta proveniente de mastitis bovina en 1908. La BCG se ha utilizado desde 1921 y se calcula que se han administrado desde entonces más de 2.5 billones de dosis, lo cual la convierte en la vacuna más utilizada en la población humana hasta el momento. De hecho, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda la vacunación con BCG en lugares en donde la incidencia y prevalencia de la tuberculosis es alta. Esta recomendación se sigue en 230 países.2,3 La BCG tiene la ventaja de ser barata y segura, pues son  muy raras complicaciones como la diseminación sistémica posvacunal en niños, incluso en los infectados con el VIH.4 Además, la BCG tiene una actividad eficaz como coadyuvante tanto para la inmunidad celular como para la humoral; por este motivo también se usa en el tratamiento contra el cáncer de vejiga urinaria.

Por lo regular, la BCG se aplica poco después del nacimiento en una sola dosis, lo cual induce repuesta protectora durante largo tiempo. Algunas investigaciones recientes en indios de Norteamérica y nativos de Alaska demostraron que la efectividad protectora de la BCG puede tener una vigencia de 50 a 60 años.5 En la población infantil, la BCG evita las formas graves de tuberculosis, como la forma miliar o la meníngea.6

Sin embargo, a pesar de todas las ventajas mencionadas de la BCG, esta vacuna tiene también la enorme desventaja de que el grado de protección que confiere es extremadamente variable.6 Por ejemplo, en Inglaterra, la protección que proporciona
la BCG es de 50 a 80%, en tanto que en Malawi, Africa, o en el sur de la India la protección es cero.7 Las causas de este fenómeno son múltiples y han generado mucho debate e investigación. Algunas de las causas o factores mejor definidos son:

a) el amplio espectro de virulencia que existe entre las cepas de M. tuberculosis;

b) la pérdida progresiva de la capacidad de la vacuna para estimular una respuesta inmunitaria protectora;

c) el nivel de exposición a micobacterias saprófitas; d) la diversidad genética entre las subcepas de BCG.8

Debido a esta amplia variabilidad en la protección que confiere la vacuna BCG, hay un interés mundial en el desarrollo de nuevas y más efectivas vacunas para evitar la tuberculosis con el fin de controlar en forma eficaz a esta grave enfermedad infecciosa.

Los avances recientes en las características inmunológicas y en el conocimiento sobre los genes de M. tuberculosis, así como el desarollo de nuevas tecnológías de la biología molecular han contribuido a producir nuevos candidatos vacunales racionalmente diseñados. Algunos de ellos, cuando menos en modelos experimentales en animales, son más efectivos para evitar la tuberculosis que la vacuna BCG. En este sentido, existen dos tipos de estrategias para el desarrollo de las nuevas vacunas. El primero son las vacunas inertes o no vivas, entre las que están los antígenos puros inmunodominantes (vacunas de subunidades) y vacunas de ADN. La segunda estrategia es la producción de vacunas vivas, las cuales corresponden a cepas atenuadas de M. tuberculosis producidas con genes mutados o eliminando genes que codifican factores de virulencia (mutantes auxotróficas);9 también  se recurre a la manipulación genética de la vacuna BCG producida por la transfección y sobreexpresión de genes micobacterianos que expresan antígenos inmunodominantes (BCG recombinantes).*

* Hernández-Pando R, Castañón M, Espitia C, López Vidal Y.

La respuesta inmunitaria en la tuberculosis y su relación con el desarrollo de vacunas nuevas y más eficientes para prevenirla

Los linfocitos Th-1 y los macrófagos activados producen la inmunidad protectora en la tuberculosis. 11 El pulmón es la puerta de entrada más común de M. tuberculosis que es un órgano con un microambiente adecuado para la reproducción lenta de esta bacteria. La infección se establece en los macrófagos alveolares y las células epiteliales de las vías aéreas, en donde se producen fenómenos protectores importantes de la inmunidad adquirida, como la producción de defensinas y otros factores. Después de tres a cinco semanas se activa la inmunidad adquirida en la que participan en forma importante los linfocitos CD4 y CD8, los cuales son esenciales en la inmunidad protectora porque secretan citocinas, como la interleucina (IL) 12 y el interferón gamma (IFN), con lo cual activan macrófagos que fagocitan y eliminan a la bacteria. 10,11 Las personas que tienen defectos mutacionales y, por lo tanto, no producen IFN o IL-12 son muy susceptibles a las infecciones micobacterianas, lo que confirma la importancia de la respuesta Th-1 en la inmunidad protectora contra M. tuberculosis. 10,11 Por esta razón, la principal estrategia en el desarrollo de nuevas vacunas es la mayor inducción o el refuerzo de la respuesta Th1. Varias vacunas vivas nuevas con esta actividad están por ahora en la fase clínica de su estudio.

A pesar de ello, tanto en seres humanos como en ratones, M. tuberculosis origina con rapidez una potente respuesta Th1, que en 90% de los individuos representa un control eficiente del crecimiento de la bacteria, con lo cual se evita el desarrollo de la enfermedad activa. En tanto, otros sujetos, incluso a pesar de una vigorosa respuesta Th1, llegan a padecer la enfermedad activa. Entonces, ¿por qué a pesar de activarse la inmunidad protectora algunas personas manifiestan la enfermedad? Una explicación hipotética es que estos individuos desarrollan una excesiva respuesta inmunorregulatoria que inhibe en forma activa la actividad protectora. Hay algunos pacientes que manifiestan respuestas anérgicas y lesiones necróticas.13 Por lo tanto, la actividad inmunorregulatoria es variable en la tuberculosis, y al parecer M. tuberculosis es una bacteria virulenta no sólo porque induce una respuesta Th-1 deficiente sino también porque tal vez la bacteria puede corromper la respuesta Th-1, lo cual impide el control del crecimiento bacilar y lleva el proceso hacia una respuesta inmunopatolóogica.12,13 El exceso en la activación de las células Th-2 y la producción de IL-4 podrían ser el factor corruptor de la respuesta Th-1.13 Algunos resultados experimentales en ratones Balb/c a los que se les extirpó el gen que codifica a la IL-4 señalan que dichos animales sufren una enfermedad que avanza con lentitud, pero además manifiestan menos fibrosis y necrosis inducida por la citocina proinflamatoria TNF.14 Por lo tanto, la caracterización hipotética de los antígenos micobacterianos que inducen la activación de células Th-2 y su posible conversión a que inciten respuestas Th-1 podría ser una forma nueva y efectiva de prevenir la tuberculosis.13 En la actualidad, este tipo de estrategia está en perfeccionamiento en el laboratorio del autor.

Vacunas constituidas por subunidades de antígenos inmunodominantes

Se han identificado antígenos micobacterianos inmunógenos clave en el huésped sano mediante análisis inmunológico. Estos antígenos se purificaron y utilizaron como potenciales agentes vacunales. Por ejemplo, en ratones inmunizados con el antígeno Mtb72F junto con el coadyuvante AS01B se induce una respuesta intensa Th-1 y de células CD8, lo cual protege a los animales de experimentación de manera tan eficaz como la BCG. En la actualidad está en fase de ensayo clínico en seres humanos.15

El antígeno ESAT-6 también confiere un alto grado de protección a los ratones.16 Cuando este antígeno se fusiona con el antígeno 85b, el cual también es muy inmunógeno, y se administran en combinación con un coadyuvante en ratones, se induce una protección efectiva similar a la de la BCG en un amplio espectro de la dosis, y con memoria inmunológica estable por 30 semanas después de la vacunación.17 Este último punto es importante porque el problema principal que tienen las vacunas de subunidad es la duración corta de su efecto protector, debido a que no se expresan en un microorganismo vivo que se reproduzca y mantenga un estímulo antigénico constante. Por eso mismo, su principal ventaja radica en su alta seguridad, pues como no son vacunas vivas no producen tuberculosis activa o diseminada ni en sujetos profundamente inmunosuprimidos.

En países en donde la tuberculosis es endémica, la vacunación con BCG se utliliza en forma masiva; por lo tanto, en los países en vías de desarrollo la mayoría de los pacientes ya fue vacunada con BCG. Asi mismo, en estas zonas se convive con muchísimas micobacterias saprófitas, por lo que la infección parasitaria es muy común.18 Además de éste, el otro aspecto importante de las vacunas de subunidad es que se aplican a sujetos previamente vacunados con BCG, y se las usa como refuerzos (boosting) para mantener e intensificar la protección. Los protocolos que se han elaborado en este aspecto han arrojado también buenos resultados, 19 por ejemplo, al utilizar el Ag85A solo o expresado en el virus vaccinia llamado Ankara, el cual estimula una intensa respuesta protectora.20 Como ya se mencionó, 90% de los sujetos que se infectan por primera vez es capaz de controlar el crecimiento de la bacteria mediante la respuesta Th-1. Sin embargo, alrededor de 30% de las personas en las que se ha controlado la infección no elimina por completo la bacteria. Estas personas tienen una escasa cantidad de bacterias vivas en sus tejidos, pero no están enfermos ni transmiten la enfermedad. Este trastorno se denomina infección latente, y se calcula que un tercio de la humanidad se encuentra en esa situación. En los países donde la endemia es baja, la reactivación de la infección es la causa más común de tuberculosis activa. 21 La infección latente es un trastorno que requiere vacunas efectivas para prevenir su reactivación, sobre todo en individuos inmunodeprimidos por enfermedades comunes, como la diabetes, SIDA, cáncer o hasta por cuestiones fisiológicas como el envejecimiento.

En los hombres y animales de experimentación se ha demostrado que la infección latente es inducida y mantenida por la respuesta Th-122. De acuerdo con la teoría, las micobacterias en estado latente deben expresar antígenos específicos de esta afección, y algunos de ellos, sobre todo los expresados en la superficie, deben ser estimuladores eficaces de las células Th-1. Se supone que la caracterización de estos antígenos y su uso como vacunas de subunidad pueden reforzar la respuesta Th-1, con lo cual se evitaría su reactivación. Algunos resultados recientes del grupo local de investigación demuestran que esto es posible si se utiliza un modelo experimental de infección latente. En efecto, ratones F1 C57bl/DBA con infección latente expresan el antígeno PE-PGRS-Rv1759 en la superficie de ciertas bacterias, con lo cual se induce una producción efectiva de IFN por parte de los linfocitos pulmonares y, sobre todo, en los ganglios linfáticos mediastínicos. La vacunación de ratones con infección latente con este antígeno protege en forma notable contra la reactivación inducida por la corticosterona.*

* Campuzano J, Aguilar D, González-y-Merchant J, Salas P, Espitia C, Hernández-Pando R. The PGRS domain of Mycobacterium tuberculosis. PE PGRS Rv1759 is an efficient subunit vaccine to prevent reactivation in a murine model of chronic tuberculosis. Vaccine. Mimeografiado.

Vacunas de ADN

Diversos autores han informado que a pesar de la alta similitud que existe en la proteína de estrés térmico HSP 65 de la micobacteria y los mamíferos, ésta provoca una gran estimulación antigénica en animales infectados.23 Se ha demostrado que tal proteína puede tener una actividad inmunorreguladora (26) y, además, puede inducir también linfocitos T citotóxicos CD8, los cuales protegen en diversos estudios en animales porque destruyen de manera efectiva macrófagos infectados.25 Lowrie y colaboradores crearon una vacuna de ADN que contiene el gen de la proteína HSP 65 de M. leprae en un vector plasmídico, la cual proporcionó protección eficaz al administrarla por vía intramuscular a ratones Balb/c.26 Es interesante hacer notar que esta vacuna también fue efectiva al prevenir la reactivación  en ratones infectados durante largo tiempo, al administrarla ocho semanas después de infectar por vía intravenosa a ratones Balb/c.27 Además, cuando se utilizó en forma terapéutica y se administró junto con antibióticos ordinarios, también redujo el tiempo de antibioticoterapia.28 Vale la pena hacer notar que esta vacuna también disminuyó la cantidad y actividad de las células Th-2 productoras de IL-4,27 al mismo tiempo que incrementó la producción de IFN- <<<debe ser gamma>>> y linfocitos CD8 citolíticos.

Al compararlo con las vacunas de subunidades y de ADN administrado a través de plásmidos o como ADN desnudo, el sistema de adenovirus que expresa genes que codifican antígenos micobacterianos inmunodominantes es más eficaz para expresar el transgén y para administrarlo en forma directa en la mucosa bronquial. En particular, los adenovirus (Ad) se utilizan sobre todo para transferir genes en animales y seres humanos en protocolos de terapia génica29 o vacunación.30 Los vectores Ad, cuando se usan como inmunomoduladores y no como un vector de reemplazo génico, tienen las siguientes ventajas:

a) son inocuos para los seres humanos;
b) son genéticamente incapaces de reproducirse (alta seguridad);
c) su tropismo natural es por el epitelio bronquial, lo cual permite usarlos como agentes excelentes para transferir genes en el pulmón;
d) el esqueleto del Ad es un coadyuvante eficiente para linfocitos tipo 1.

El concepto del vacunas constituidas por genes expresados por adenovirus mediante la administración intranasal se apoya en la licencia de la vacuna FluMist de Europa Occidental y Norteamérica. Esta es la primera vacuna de un virus atenuado pero capaz de reproducirse. Además, es una vacuna trivalente para la gripe que se administra por vía intranasal y que tiene una gran efectividad y seguridad.31

Hay excelentes informes sobre los resultados de usar vacunas de adenovirus como vectores de antígenos micobacterianos.32,33 Xing ha demostrado que usar el adenovirus que expresa al antígeno inmunodominante 85A como vacuna es mucho más efectivo que el plásmido de ADN que codifica al mismo gen cuando se administra por vía intranasal, y confiere una mayor capacidad protectora después del reto con la cepa de Mtb de laboratorio H37Rv. En cambio, la ruta parenteral de vacunación resultó ineficaz.34,35 Por lo tanto, es importante estudiar nuevas vacunas que inmunizan por vía nasal, la cual puede ser más eficaz que la tradicional vía subcutánea.

BCG recombinantes como nuevas vacunas para la tuberculosis

Se utilizaron tres estrategias para producir BCG recombinantes

a) la primera se fundamenta en la restauración de los genes que la BCG ha perdido como consecuencia de su atenuación;

b) la segunda es la transfección y sobreexpresión de genes de la micobacteria que codifican antígenos inmunodominantes;

c) la tercera estrategia es la transfección de genes que codifican interleucinas esenciales para la protección antimicobacteriana, como la IL-2, IFN o IL-18 con el propósito de incrementar la capacidad inmunoestimulatoria del BCG.*

Es interesante observar que varias de estas BCG recombinantes proporcionan mejor protección que la BCG parenteral en modelos experimentales, y algunas de ellas ya se encuentran en fase de estudios clínicos.

Varios factores son importantes para diseñar y probar las nuevas vacunas BCG recombinantes, algunos se relacionan con la construcción genética y otros con los ensayos preclínicos.36 En relación con  la construcción genética, las características del vector de expresión y las secuencias blanco son muy importantes puesto que determinan el momento y la cantidad del antígeno que se producirá, lo cual influye de modo directo en el momento y la ruta de activación del sistema inmunológico.36 La mayor parte de los vectores de transfección son sistemas de E. coli, que es una micobacteria que  se mantiene en forma episómica o integrada al genoma bacteriano. En este último caso, se producen BCG recombinantes más estables. También es necesaria la presencia de promotores activos, pues la fuerza de éstos determina la producción del ARN mensajero.37 La forma como los antígenos se expresan es una cuestión muy importante en la activación del sistema inunológico. Hay BCG recombinantes que confinan al antígeno de expresión en el citoplasma, la membrana-pared celular o que lo secretan. Los antígenos que quedan confinados en el citoplasma son procesados en forma deficiente, y retrasan la activación del sistema inmunológico. Por lo que toca a los antígenos que se secretan, su proceso es más eficiente así como en la activación del sistema inmunitario.38 Desde 1921, año en el que se empezó a usar la BCG como vacuna, hasta 1961 cuando la OMS recomendó liofilizarla y almacenarla a -80ºC, muchos laboratorios de todo el mundo la subcultivaron, lo cual ocasionó que se generara gran cantidad de subcepas con diferentes estructuras genéticas.39 Esta diversidad en la estructura genética se relaciona con un grado diferente de protección, que está demostrado en modelos experimentales.40 Por lo tanto, es fundamental seleccionar la subcepa idónea de BCG, la más protectora desde el punto de vista teórico, para usarla como cepa parental en la producción de BCG recombinantes.

El gen que codifica al antígeno ESAT-6 fue eliminado durante el proceso de atenuación de la BCG. De hecho, de los seis antígenos inmunodominantes de M. bovis (ESAT-6, CFP-10, Ag85, MPB64, MPB70 y MPB83), cinco fueron eliminados en ese proceso. La transfección del gen que codifica ESAT-6 generó una BCG recombinante eficaz.41 De forma similar, el BCG recombinante que sobreexpresa y secreta el antígeno inmunodominante 85B protege más que la BCG ordinaria en el modelo de tuberculosis en cobayos.42 También la BCG recombinante que sobreexpresa al antígeno P38, un transportador de fosfatos de la micobacteria muy inmunógeno, produjo mejor respuesta protectora que la BCG parenteral, sobre todo en ratones vacunados y retados con la cepa hipervirulenta Beijing 9501000.43 De especial interés es la BCG a la que se sometió a transfección con gen de listeriolisina, una proteína de L. monocytogenes que activa a una citolisina productora de poros, la cual permite la liberación de la bacteria que se encuentran en vacuolas fagosómicas. Este proceso facilita la presentación antígénica expresada en un contexto de proteínas de clase 1 del CMH. Esta BCG recombinante estimula con fuerza la actividad citolítica de las células CD8, y también protege mejor que la BCG ordinaria. En la actualidad, esta vacuna ya se encuentra en estudios clínicos.44

Mutantes atenuadas de M. tuberculosis como nuevas vacunas

Las técnicas nuevas con las que se manipula el genoma de M. tuberculosis, así como el conocimiento del genoma completo de la bacteria45,46 facilitan el estudio de la contribución de genes específicos en la virulencia de M. tuberculosis.47 Una de las estrategias fue la producción de micobacterias mutantes, las cuales se usan para infectar ratones o cobayos y estudiar luego la sobrevida de los animales y la cantidad de bacterias vivas en los tejidos. Mediante diversos estudios de este tipo se han podido dar las características de mutantes auxotróficos con diferentes grados de atenuación. Alguos de éstos han resultado también vacunas efectivas, pues inducen estimulación inmunológica más intensa y durante mayor tiempo que la
BCG.9

Los atributos esenciales que deben poseer las bacterias mutantes vivas atenuadas para considerarlas como buenas opciones vacunales son seguridad, es decir, deben ser tan seguras o más que la BCG y protejer igual o mejor que la BCG.9 Para ello se debe mostrar en modelos animales, ratones, cobayos, primates, que las mutantes están muy atenuadas, incluso en ratones genéticamente inmunodeficientes (que corresponden a las siglas en inglés SCID, desnudos). Se considera que si el grado de protección que proporciona la mutante no es tan bueno como el producido por BCG, pero su nivel de atenuación es mayor que el de la BCG, es un buen candidato porque puede administrarse como vacuna en sujetos inmunodeprimidos.

Una de las características más distintivas de M. tuberculosis es su alto contenido de lípidos en la pared celular, lo que constituye 40% de su peso seco.48 De hecho, la síntesis y el metabolismo de los lípidos son decisivos para la reproducción y persistencia intracelular de las micobacterias.48 Las mutaciones genéticas que afectan el metabolismo lipídico pueden atenuar en forma acentuada la virulencia y preservar la antigenicidad. Esto convierte a dichas mutantes en buenos candidatos vacunales. Por ejemplo, la doble mutante pnC/panD que corresponde a genes dependientes del ácido pantoténico, al ser eliminada se afecta la síntesis de poliquétidos y se producen bacterias más atenuadas que proporcionan protección similar a la de BCG.49 La cepa fadD26 es otra mutante que se caracteriza por no poder sintetizar dimicocerosatos de tiocerol, una familia de lípidos esenciales en la constitución de la pared celular. Esta mutante está atenuada y protege mejor que la BCG.50 Más atenuación y todavía mejor protección demostró la mutante mce2 y mce3. Ambos genes son importantes en el proceso de invasión intracelular micobacteriana en células epiteliales y macrófagos.51,52 En comparación, la mutante phoP, en la cual se eliminó un factor de virulencia importante para M. tuberculosis y M. bovis produjo un grado similar de protección que BCG en ratones, pero significativamente mejor en cobayos con una escala de atenuación mucho mayor que BCG,* lo cual la convierte en una vacuna potencialmente muy útil en personas inmunodeprimidas.

* Aguilar D, Infante E, Martin C, Eamonn G, Brigitte B, Hernández- Pando R. Immunological responses and protective immunity against tuberculosis conferred by vaccination of

Conclusión

Se han propuesto más de 200 candidatos vacunales como resultado del trabajo de investigación realizado en modelos experimentales. Algunas de esas vacunas nuevas están ahora en la etapa de ensayos clínicos. Sin embargo, en la transferencia desde los resultados experimentales hasta su utilización en ensayos clínicos y la aplicación en masa en la población humana intervienen muchos factores con consecuencias estratégicas y técnicas que aún están en proceso de estudio. No obstante, algunas prospectos de vacunas ya están en la fase clínica y otras más en estudios preclínicos. La expectativa es lograr en el mediano plazo una vacuna nueva y más efectiva que contribuya a controlar esta importante enfermedad infecciosa, la tuberculosis.

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