Salud Pública de México

Mesa redonda XXIVIdentificación y selección de proteínas clave para interrumpir la transmisión del paludismo

Mesa redonda XXIVIdentificación y selección de proteínas clave para interrumpir la transmisión del paludismo

AUTORES

Humberto Lanz-Mendoza, (1) Ivone Castro-Romero,(1) Priscilla Mercado-Salgado(1)

(1) Instituto Nacional de Salud Pública

Introducción

La malaria es una de las enfermedades tropicales de mayor importancia en el mundo y en México, por lo que se le considera un problema de salud pública. Esta enfermedad es causada por un protozoario parásito del género Plasmodium y transmitida por mosquitos del género Anopheles. A pesar del uso de insecticidas y compuestos químicos no se ha logrado su erradicación. Por otro lado, no se cuenta con una vacuna efectiva que permita su prevención. Lo anterior destaca la necesidad de buscar otras opciones para controlar esta enfermedad.

El ciclo de vida del parásito de la malaria se divide en dos fases, sexual y asexual. La primera se da en el mosquito y la otra ocurre en el hospedero vertebrado. En el mosquito, la infección inicia durante la alimentación de sangre infectada con gametocitos. Estos son liberados en el intestino medio y ahí se diferencian en gametos masculinos y femeninos. En este mismo sitio tiene lugar la fecundación. El cigoto evoluciona a una fase móvil conocida como oocineto, que invade el epitelio intestinal, y llega con gran rapidez al espacio entre éste y su lámina basal. En este sitio se establece para realizar una meiosis y múltiples mitosis, con lo cual se forman cientos de esporozoítos que están contenidos en un ooquiste. Más tarde, los esporozoítos maduros son liberados en el hemocele para alojarse en las glándulas salivales. El esporozoíto es transmitido otra vez al hombre por medio de la picadura del mosquito infectado.

Lo anterior subraya la necesidad de investigar algunos aspectos básicos de los mecanismos de defensa del mosquito Anopheles con el fin de identificar rutas que permitan modificar su fisiología como parte de una estrategia para controlar las poblaciones de mosquitos, así como la transmisión de la malaria. La información básica sobre el desarrollo del parásito en el vector y de los mecanismos de defensa del mosquito durante la infección permitirá el desarrollo de nuevas estrategias basadas en la manipulación genética de los mosquitos vectores.

Una estrategia que ha permitido la identificación rápida de proteínas que se expresan o se producen en células o tejidos y en distintas condiciones fisiológicas es la proteómica, la cual ya demostró que es fundamental para la investigación biomédica actual.

Proteómica

El término proteoma fue acuñado por Wilkins en 1994 (cf. Cohen, 2001)1 para definir a todas las proteínas que expresa un genoma en un tejido o en una célula. Proteómica es la disciplina científica que estudia los proteomas, y se puede dividir en proteómica de expresión y proteómica funcional. La primera se concentra en la descripción del proteoma total de un tejido, líquido, tipo celular u organelo y en las mediciones diferenciales de los grados de expresión de proteínas en muestras colectadas en distintas condiciones. La proteómica funcional se encarga de estudiar la función de las proteínas dentro de sistemas biológicos y la regulación de su expresión e incluye el análisis directo de un subgrupo de proteínas como familias o proteínas con relación funcional, así como de aquello que caracteriza sus funciones biológicas, sin olvidar las interacciones entre proteínas, entre proteínas y ADN/ARN o las modificaciones posteriores a la traducción.

Las muestras proteínicas provenientes de células, tejidos u otro tipo de muestras biológicas se separan mediante técnicas electroforéticas o cromatográficas. La electroforesis bidimensional (2D) es la técnica más común para el estudio proteómico. Sin embargo, debido a la introducción de la cromatografía líquida de fase inversa capilar con nanoflujo acoplada a los espectrómetros de masas (LC-MS) y de la cromatografía líquida multidimensional acoplada a los espectrómetros de masa tipo electrospray (ESI), en los últimos años se ha establecido el uso de la cromatografía líquida en la separación de péptidos provenientes de digestiones proteolíticas para identificarlos después mediante espectrometría de masas (EM). No obstante, la herramienta principal de la proteómica es la EM, ya que a fines de los años ochenta, los científicos Fenn y Tanaka (Fenn y colaboradores, 1988; Tanaka y colaboradores 1989)2,3 perfeccionaron los sistemas de ionización de macromoléculas. El primero investigó sobre la ionización por electropulverización, ESI (siglas que provienen del inglés electro spray ionization) a partir de una solución acuosa de proteínas, y Tanaka desarrolló el método de ionización por MALDI (siglas de la expresión inglesa matriz laser assisted ionization), en el que se bombardean con rayos láser muestras proteínicas en estado sólido o viscoso, con lo que se dispersan en fragmentos ionizados de pequeño tamaño. Estas técnicas solucionaron la dificultad de generar iones a partir de analitos no volátiles (proteínas y polímeros).

A partir de este momento, la EM desplazó a la secuenciación de proteínas de Edman, que era el método tradicional para estudiar las proteínas, debido a su sensibilidad (pmol-fmol), exactitud (100-5 ppm) y rapidez (minutos). Esta técnica permite identificar proteínas, conocer su estructura primaria (secuencia de a-a), identificar sus modificaciones posteriores a la traducción y cuantificar la expresión proteínica (proteómica cuantitativa). Empero, es importante resaltar que la EM mide masas de distintas moléculas, por lo que se puede identificar nucleótidos, carbohidratos, lípidos y polímeros sintéticos.

Proteómica en insectos vectores de enfermedades

Son escasos los estudios de proteómica realizados en insectos vectores de enfermedades, y hasta el momento no se ha analizado el papel de los parásitos  o agentes patógenos de importancia médica en la expresión de proteínas en los distintos tejidos de sus vectores. No obstante, en estudios recientes se identificaron proteínas relevantes para la fisiología y la respuesta inmunitaria de los insectos vectores.

Kalume y colaboradores (2005)4 realizaron el análisis proteómico de las glándulas salivales de hembras del mosquito An. gambiae. Se alimentó a un grupo de hembras con sangre humana infectada con Plasmodium, y un día después de haberlo hecho se les extrajo el par de glándulas salivales.

Utilizando geles de 2D y EM se pudieron identificar nueve proteínas ya conocidas, entre ellas la D7r1 a D7r5, una proteína putativa gVAG, la histona H3, una proteína gSG6 y una TRIO, así como 17 proteínas nuevas. La mayoría de estas últimas contiene dominios de unión a feromona/odorante que son las proteínas D7r, distribuidas en muchos de los artrópodos. Estas moléculas son hidrófobas; se les conoce como OBP (cuyas siglas corresponden a la expresión Odorant Binding Protein) e incrementan la solubilidad de los odorantes, por lo que es más fácil que los detecten las neuronas receptoras sensoriales. Se supone que las OBP se encuentran en la hemolinfa que cubre las neuronas sensoriales de los insectos; dichas neuronas pueden estar relacionadas con la quimiorrecepción y búsqueda de blancos  alimenticios del mosquito Anopheles. Por lo que se refiere a la proteína gVAG determinada, esta familia se caracteriza por constituir potentes alergenos, con péptido señal, lo cual también indica que son proteínas secretadas. En cuanto a las diversas proteínas gSG (gSG6, 7 y 1b), sus funciones no están determinadas. Asimismo, se determinaron una proteína putativa 5’-nucleotidasa y una isomerasa de disulfuro.

Paskewitz y Shi (2005)5 estudiaron el perfil de expresión de la hemolinfa de An. gambiae ante la presencia de bacterias como E. coli y M. luteus. Analizaron perfiles que contenían 250 proteínas totales que estaban consideradas en todas las muestras con excepción de 32 proteínas adicionales que fueron inducidas por el daño o inoculación por bacterias. La mayor parte de las proteínas que constituyen la hemolinfa había sido predicha por péptidos señal, y es secretada por el plasma. Una proteína que fue abundante y que forma parte de la hemolinfa es una subunidad de la fenoloxidasa (PO; PPO2, formalmente llamada PPO-p1), que carece de de péptido señal. Esta incluye dos dominios CLIP de proteasas de serina (CLIP B4 y A6), una proteína con enlace tioéster (TEP15), dos serpinas (SRPN2 y SRPN15), una cistatina y una apolipoforina II (apoLP-III). Las PO están relacionadas con la activación de la cascada de la PPO, que es importante en la melanización de agentes patógenos y parásitos así como en la transducción de señales asociadas con la respuesta inmunitaria.

Biron y colaboradores (2005)6 realizaron el análisis proteómico en larvas de Ae. aegypti de cinco y 15 días infectadas con esporas de Vavraia culicis. De ellas se extrajo el cuerpo graso que se analizó mediante geles 2-DE. En larvas de cinco días retadas con V. culicis se indujo la producción de proteínas de la MP, que reforzaron la barrera estructural contra el parásito. También se expresaron componentes relacionados con la activación de NF-kB (Rel), así como varias OBP (que han sido halladas en la hemolinfa) cuya tarea es identificar y neutralizar a los agentes infecciosos. En larvas de 15 días se encontraron seis proteínas expresadas de manera diferencial, las cuales se relacionan con el metabolismo de L-arginina y L-ornitina, entre ellas aminotransferasa de ornitina (OAT), la S-transferasa de glutatión D6 (GSTs D6), la antienzima descarboxilasa de ornitina (ODC-AZ), la S-transferasa de glutatión 1-5 (GSTs 1-5), y la sintasa de óxido nítrico. El NO y la arginina compiten por sustratos como la L-arginina. Las arginasas participan en la síntesis de poliaminas, aminoácidos y neurotransmisores.

Estos estudios destacan la importancia de la proteómica para identificar proteínas diferenciales que se expresan o producen en distintas condiciones fisiológicas en los insectos.

Proteómica del la interacción Anopheles albimanus-Plasmodium

Con estos antecedentes, el grupo autoral inicio el estudio de la o las moléculas del mosquito An. albimanus, uno de los principales vectores de la malaria en México y Centroamérica, que permiten el desarrollo de Plasmodium o que ayudan a eliminarlo. Esta información permitirá establecer moléculas blanco para bloquear el desarrollo del parásito en su vector. An. albimanus es resistente al la transmisión de P. berghei y lo elimina en el epitelio intestinal, pero es susceptible a la infección con P. vivax y lo transmite a hospederos humanos.

Con apoyo en estos modelos de infección, está en marcha un análisis comparativo de las proteínas diferenciales presentes en tres de los principales tejidos del mosquito, que interactúan y responden a la presencia del parásito: intestino, hemolinfa y cuerpo graso. Se espera obtener información sobre el proteoma del mosquito y sobre proteínas que están relacionadas con la respuesta inmunitaria del mosquito con el fin de seleccionar las que podrían bloquear la transmisión del parásito. Para cumplir este objetivo se empezó el análisis de los perfiles proteínicos por medio de geles en 2D, así como los perfiles de masas mediante MALDI-TOF del intestino y cuerpo graso, además del análisis de la hemolinfa por medio de HPLC de mosquitos infectados con Plasmodium.

E
l estudio mediante HPLC de la hemolinfa de mosquitos alimentados con sangre infectada con P. berghei facilita la identificación de dos péptidos de 877 y 861 de ion/masa. Estos péptidos no están presentes en la hemolinfa de mosquitos alimentados con sangre que no está infectada. La secuencia por ESI del péptido de 861 permitió determinar su homología con la proteasa H15 presente en la hemolinfa de Manduca sexta, que es activada durante la respuesta inmunitaria. Además, se logró identificar la cecropina C3 en la hemolinfa de mosquitos alimentados con P. berghei. En la actualidad se investiga el papel biológico de estos péptidos. El análisis de las proteínas de las carcasas (que contiene principalmente el cuerpo graso) en geles de 2D y mediante MALDI-TOF permite identificar al menos 10 proteínas diferenciales que están en mosquitos alimentados con sangre infectada. Dentro de éstas sobresalen wingless, citocromo P-450 y una proteína que tal vez se relacione con la ubiquitinación de proteínas. La proteína wingless es muy importante en la morfogénesis y también en la respuesta inmunitaria de Drosophila, pero se desconoce su función en los mosquitos. El citocromo P-450 desempeña diversas funciones, sobre todo en la eliminación de xenobióticos. Las proteínas identificadas hasta este momento requieren un análisis funcional más detallado para determinar su papel en la eliminación del parásito de la malaria.

Bibliografía

1. Cohen J. The proteomics payoff. Technol Rev 2001;55-60.
2. Fenn JB, Mann M, Meng CK, Wong SF, Whitehouse CM. Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules. Science 1989;246:64-71.
3. Tanaka K, Waki H, Ido Y, Akita S, Yoshida Y, Yoshida T. Protein and polymer analysis up to m/z 100,000 by laser ionization time-offlight mass spectrometry rapid common. Mass Spectrom1988;2:151.
4. Kalume DE, Okulate M, Zhong J, Reddy R, Suresh S, Deshpande N, et al. A proteomic analysis of salivary glands of female Anopheles gambiae mosquito. Proteomics 2005;5:3765-3777.
5. Paskewitz SM, Shi L. The hemolymph proteome of Anopheles gambiae. Insect Biochem Mol Biol 2005;35:815-824.
6. Biron D G, Agnew P, Marché L, Renault L, Sidobre C, Michalakis Y. Proteome of Aedes aegypti larvae in response to infection by the intracellular parasite Vavraia culicis. Int J Parasitol 2005; 35:1385-1397.

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